劉 慶，段潤甲，周遠(yuǎn)飛，魏宏逵，彭 健,2

（1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)系，湖北武漢 430070；2. 生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430070）

止痢草油對公豬精子形態(tài)、精子膜及抗氧化作用的影響

劉 慶1，段潤甲1，周遠(yuǎn)飛1，魏宏逵1，彭 健1,2*

（1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)系，湖北武漢 430070；2. 生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430070）

試驗旨在研究魚油飼糧中止痢草油添加量對公豬精子形態(tài)、精子膜及抗氧化作用的影響。選用34頭健康成熟公豬，隨機(jī)分為4組，分別飼喂添加100 mg/kg維生素E（1組，n=8）和250（2組，n=8）、500（3組，n=9）、750 mg/kg（4組，n=9）的止痢草油飼糧，試驗期16周。結(jié)果表明：在整個試驗期，試驗3組的精子遠(yuǎn)端原生質(zhì)滴比例低于1組（P＜0.05），試驗3組在16周的精子正常形態(tài)分別較試驗1和4組有極顯著提高（P＜0.01）；在整個試驗期，試驗2、3和4組精清超氧化物歧化酶活性均高于1組（P＜0.05）；試驗2和3組膜結(jié)構(gòu)完整性在12周較4組有顯著提高，而試驗3組膜結(jié)構(gòu)完整性和線粒體膜電位在16周較1和4組有顯著提高（P＜0.05）。結(jié)果提示，魚油飼糧添加止痢草油可增強(qiáng)公豬血清和精清抗氧化能力，添加500 mg/kg止痢草油有利于精子膜的改善，從而改善了精子形態(tài)。

公豬；止痢草油；精子形態(tài)；精子膜；抗氧化

人工授精技術(shù)的發(fā)展使公豬在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的作用愈加重要，而低品質(zhì)精液是母豬人工授精成功的限制因素之一。其中，公豬精子形態(tài)是精子受精能力的關(guān)鍵指標(biāo)，如精子畸形率與母豬受胎率呈負(fù)相關(guān)[1]。研究表明，魚油飼糧有利于公豬精液品質(zhì)的改善[2]。然而魚油日糧富含的多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acids，PUFA）會增加精子脂質(zhì)過氧化敏感性[3]，損傷精子膜完整性，不利于精子形態(tài)和受精能力[3-4]。日糧抗氧化劑（如維生素E）常用來緩解這種脂質(zhì)過氧化。本試驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，400 mg/kg維生素E較200 mg/kg維生素E降低了精子脂質(zhì)過氧化，改善了精子活力[5]。Strzezek等[2]報道，魚油飼糧添加抗氧化劑可改善9～16周公豬精子抗氧化酶活性。因此，進(jìn)一步延長試驗周期可能提高抗氧化狀態(tài)并改善精子形態(tài)。止痢草油（Oregano Essential Oil，OEO）是天然的植物提取物，富含香芹酚和百里香酚，具有與維生素E效果相當(dāng)?shù)目寡趸芰?。母豬飼糧添加OEO可緩解機(jī)體氧化應(yīng)激水平，并改善母豬繁殖性能[6]。目前還未見OEO對公豬繁殖性能的影響。為阻止魚油飼糧可能引起的睪丸組織及精子的過氧化損傷，添加抗氧化能力與維生素E相當(dāng)?shù)腛EO，研究其對公豬血清和精清抗氧化狀態(tài)的調(diào)節(jié)，從而為OEO緩解氧化應(yīng)激對精子膜功能及精子形態(tài)的氧化損傷提供依據(jù)和支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 大豆油選用山東渤海實業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的飼料級豆油（含51.8%亞油酸，C18:2n-6）；魚油為山東榮成愛爾斯海洋生物科技有限公司提供（含25% C22:6n-3和10% C20:5n-3）；維生素E選用浙江新和成股份有限公司生產(chǎn)的DL-α-生育酚醋酸酯（純度50%）；止痢草油為廣州美瑞泰科生物工程技術(shù)有限公司生產(chǎn)提供（商品名為Phytogen，主要活性成分為香芹酚2.75%，百里香酚0.075%）。

1.2 試驗設(shè)計及飼糧 試驗選取34頭年齡（544±51.4d）和體重（264±7.9 kg）接近的杜洛克公豬（選自廣西揚翔股份有限公司豬基因分公司武鳴公豬站）開展動物飼養(yǎng)試驗。試驗公豬每日攝入2.5 kg基礎(chǔ)飼糧（見表1），45 g豆油和15 g魚油（為實現(xiàn)公豬日糧n-6:n-3比為6.6:1）。本試驗飼喂的魚油日糧基于前期試驗結(jié)果，即為滿足公豬精子n-3 PUFA的需要[8]。所有的試驗飼糧參照NRC[7]滿足或超過公豬營養(yǎng)需要配制為等能等氮飼糧。本試驗不以研究日糧n-3 PUFA對公豬精液品質(zhì)的影響為目的，因此未飼喂公豬不添加魚油的日糧。試驗公豬按照年齡和體重相近原則隨機(jī)分為4組，分別飼喂添加100 mg/kg維生素E（1組，n=8）和250（2組，n=8）、500（3組，n=9）、750 mg/kg（4組，n=9）的OEO飼糧。試驗期16周。

表1 基礎(chǔ)飼糧和營養(yǎng)成分（飼喂基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理 飼養(yǎng)試驗在廣西揚翔股份有限公司豬基因分公司武鳴公豬站進(jìn)行。按豬場正常程序免疫和驅(qū)蟲、清潔和消毒，保持圈舍通風(fēng)、衛(wèi)生和干燥。試驗公豬單欄飼養(yǎng)，每天飼喂2次，分別在08:00和17:00飼喂，自由飲水。本試驗0周（正式試驗前1周）到10周舍內(nèi)溫度平均（28±2）℃，每頭公豬每日供給2.5 kg飼料；第11周到第16周進(jìn)入冬季，舍內(nèi)溫度為（17±2）℃，每頭公豬每日供給3 kg飼料。試驗期內(nèi)每兩周由同一操作熟練的技術(shù)人員采精3次。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 樣品采集 試驗期第0、8、12、16周，公豬行前腔靜脈采血10 mL，取血清于-20℃保存，用于超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）含量的測定。每次采集精液后，取10 mL新鮮精液于離心管中，在1 800×g離心分離15 min，吸取精清并分裝于-20℃保存，用于SOD、GSH-Px和MDA含量的測定；另一份精液經(jīng)常溫稀釋劑稀釋后用于精子形態(tài)和精子膜結(jié)構(gòu)和功能的檢測。其中，精子膜結(jié)構(gòu)和功能的檢測是在24 h內(nèi)17℃保存條件下送往廣西大學(xué)試驗室完成[4]。

1.4.2 公豬精子形態(tài)的測定 新鮮精液稀釋后，參照試驗室測定精子形態(tài)的方法[5]，即采用伊紅染色法測定精子形態(tài)。在400倍顯微鏡下觀察記錄200個精子后，分別對正常精子形態(tài)、畸形頭部和尾部、近端和遠(yuǎn)端原生質(zhì)滴、斷頭和卷尾精子計數(shù)，計算其與總精子數(shù)的比例。重復(fù)測定2次，計算其平均值。

1.4.3 血清和精清中抗氧化酶活和丙二醛的測定血清和精清中的SOD酶活、GSH-Px酶活和丙二醛（MDA）含量分別采用鄰苯三酚自氧化法、5′5-雙硫代對硝基苯甲酸比色法和硫代巴比妥酸比色法在酶標(biāo)儀上用南京建成生物有限公司提供的相應(yīng)試劑盒測定。試驗步驟嚴(yán)格按說明書指導(dǎo)執(zhí)行。

1.4.4 精子膜結(jié)構(gòu)和功能的測定 精子膜結(jié)構(gòu)完整性、精子膜功能完整性和精子膜流動性分別采用伊紅染色法，低滲膨脹法和熒光偏振法測定，線粒體膜電位（MMP）采用流式細(xì)胞法測定[4]。

1.5 統(tǒng)計分析 精子形態(tài)、血清和精清中抗氧化指標(biāo)及精子膜結(jié)構(gòu)和功能用SAS 8.1統(tǒng)計軟件分析。首先對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗（顯著水平P＜0.05）。對于不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，通過sqrt（x）、arsin[sqrt（x/100）]、log10（x）數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換適合后，采用有重復(fù)方差分析和多重比較，結(jié)果以平均值±混合標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P＜0.05為顯著標(biāo)準(zhǔn)，P＜0.01為極顯著標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 精子形態(tài) 由表2可知，在整個試驗期，各組公豬的精子遠(yuǎn)端原生質(zhì)滴比例差異顯著，試驗3組顯著低于1組（P＜0.05）。添加OEO具有降低精子畸形尾部比例和斷頭比例的趨勢（P=0.11），即整個試驗期畸形尾部比例為試驗3組＜2組＜4組＜1組；斷頭比例為試驗3組＜1組＜4組＜2組。試驗第16周各組公豬的精子正常形態(tài)差異顯著（P＜0.05），試驗3組分別較1組、4組極顯著提高了6%和8.9%（P＜0.01），試驗其他各組差異不顯著（P＞0.05）。

表2 日糧止痢草油對公豬精子形態(tài)的影響

2.2 血清和精清抗氧化狀態(tài) 由表3可知，添加顯著提高了精清SOD酶活，即整個試驗期精清SOD酶活為試驗3組 ＞ 2組 ＞ 4組 ＞ 1組（56.8、55.8、 53.4、46.4 U/mL；P ＜ 0.05），且3個OEO添加組之間差異不顯著（P＞0.05）。與試驗1和4組相比，試驗2和3組分別顯著提高了整個試驗期血清 GSH-Px酶活和試驗第16周精清 GSH-Px酶活（P＜0.05）。添加OEO顯著降低了第12周血清MDA含量，由低到高依次為試驗3組＜2組＜4組＜1組（P＜0.05）。在整個試驗期，添加OEO并未顯著影響精清MDA含量（P＞0.05）。然而從數(shù)值上分析，試驗2、3、4組精清MDA數(shù)值上較試驗1組稍低（2.2、2.4、2.6 nmoL/mL vs. 2.8 nmoL/mL）。

表3 日糧止痢草油對公豬血清和精清抗氧化狀態(tài)的影響

2.3 精子膜結(jié)構(gòu)和功能 由圖1可知，隨著試驗周的延長，精子膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性、膜流動性和MMP增強(qiáng)。在整個試驗期，各組公豬精子膜結(jié)構(gòu)完整性、膜功能完整性和MMP均差異不顯著（P＞0.05）；試驗4組具有降低精子膜流動性的趨勢，即整個試驗期精子膜流動性為試驗4組＜2組＜1組＜3組（P=0.06）。試驗2和3組精子膜結(jié)構(gòu)完整性在12周較4組有顯著提高，而試驗3組精子膜結(jié)構(gòu)完整性和MMP在16周較試驗1和4組有顯著提高（P＜0.05）。

3 討 論

大量研究表明，動物飼糧中添加OEO能夠明顯緩解機(jī)體氧化損傷，其主要原因是OEO可提高機(jī)體抗氧化能力，并通過自身酚羥基，還原和消除自由基的過量產(chǎn)生[9]。OEO對精子的抗氧化保護(hù)作用還未見報道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，魚油飼糧添加OEO可提高公豬血清和精清中SOD酶和 GSH-Px酶活，降低血清MDA含量，提高精子膜結(jié)構(gòu)完整性和MMP，從而改善精子形態(tài)。

3.1 魚油飼糧添加OEO對公豬精子血清和精清抗氧化狀態(tài)的影響 精清存在著豐富的抗氧化酶，SOD和 GSH-Px聯(lián)合在一起，共同發(fā)揮清除活性氧、緩解氧化損傷的作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗組添加OEO可顯著提高精清SOD活性。升高的SOD將過量的O2-轉(zhuǎn)化為H2O2，同時經(jīng) GSH-Px轉(zhuǎn)化分解為水和氧氣，從而降低過量的精子活性氧及氧化損傷程度[8-9]。而試驗2組和3組提高了血清和精清 GSH-Px酶活，提示試驗2組和3組的公豬抗氧化酶系統(tǒng)可全面得到改善，從而在活性氧清除方面較徹底，最終緩解精子氧化損傷。試驗4組中OEO添加量增加到750 mg/kg時，血清和精清 GSH-Px酶活并未得到相應(yīng)的提高。Yue等[9]報道，羊睪丸組織 GSH-Px酶活在低劑量維生素E添加時表現(xiàn)為增強(qiáng)，而高劑量如1 000 IU/（d/頭）時并未增強(qiáng)支持目前研究。

圖1 精子膜結(jié)構(gòu)和功能

精子氧化應(yīng)激是造成精子形態(tài)缺陷的重要原因[8]。公豬等哺乳動物精子中包含豐富的PUFA，特別是二十二碳六烯酸（DHA），與精子正常形態(tài)呈顯著正相關(guān)[5]；另一方面，由于脫落的細(xì)胞質(zhì)使精子抗氧化物質(zhì)大量丟失，從而使精子極易遭遇氧化應(yīng)激[8]。增多的活性氧作用于精子膜脂質(zhì)后發(fā)生過氧化反應(yīng)，而氧化終產(chǎn)物MDA的含量反映氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化程度。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著試驗周的延長，各試驗組公豬血清MDA含量均有所下降。但添加OEO的試驗組血清MDA 含量始終較對照組低。表明魚油飼糧添加OEO后提高公豬抗氧化酶活，緩解系統(tǒng)的脂質(zhì)過氧化損傷，從而緩解精子中的氧化損傷[5-10]。試驗2組、3組和4組精清MDA數(shù)值上較試驗1組低，可能間接反映精子氧化損傷程度的緩解。

3.2 魚油飼糧添加OEO對公豬精子膜功能和精子形態(tài)的影響 精子膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性是精子形態(tài)及受精能力發(fā)揮的基礎(chǔ)[11]，同時受精子氧化損傷的負(fù)調(diào)節(jié)[12]。為了驗證添加OEO對精子膜結(jié)構(gòu)和功能的保護(hù)效果，本試驗測定了精子膜結(jié)構(gòu)和功能完整性、膜流動性及MMP。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗3組精子膜結(jié)構(gòu)完整性和MMP較1組有顯著提高。Pena等[13]報道添加維生素E提高了公豬精子MMP，Surai等[14]報道添加維生素E提高了公雞精子膜結(jié)構(gòu)完整性，與本研究結(jié)果相類似。精子膜完整性和MMP與精子正常形態(tài)呈顯著正相關(guān)[12]。因此試驗3組可能是通過提高精子膜結(jié)構(gòu)完整和MMP改善精子形態(tài)和受精能力的。試驗2組在提高精子膜結(jié)構(gòu)完整性時并未提高M(jìn)MP，從而未能改善精子形態(tài)。而試驗4組中OEO添加可能過量。這是因為OEO作為酚類抗氧化劑，還原活性氧自由基后自身轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂苫?，由抗氧化性變?yōu)榇傺趸訹15]，從而損傷精子功能。本研究中試驗4組精子膜結(jié)構(gòu)完整性和流動性有降低的趨勢，從而未影響精子形態(tài)，可能支持上述研究報道。

4 結(jié) 論

魚油飼糧中添加OEO可提高公豬血清和精清中SOD和 GSH-Px酶活，降低血清MDA含量，從而提高抗氧化狀態(tài)。添加500 mg/kg OEO的飼糧可提高精子膜結(jié)構(gòu)完整性和MMP，從而改善公豬精子形態(tài)。

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Efects of Dietary Supplementation of Oregano Essential Oil on Sperm Morphology, Sperm Membrane and Antioxidant Status in Boars

LⅠU Qing1, DUAN Run-jia1, ZHOU Yuan-fei1, WEⅠ Hong-kui1, PENG Jian1,2*
(1.Department of Animal Nutrition and Feed Science, College of Animal Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Hubei Wuhan 430070, China; 2.The Cooperative Ⅰnnovation Center for Sustainable Pig Production, Hubei Wuhan 430070, China)

This experiment was aimed to study the effects of oregano essential oil (OEO) supplementation on sperm morphology, sperm membrane and antioxidant status in boars fed with fsh oil-fortifed diet. Thirty-four mature boars of proven fertility, were allocated to one of four groups supplemented with 100 mg/kg vitamin E (group 1, n=8), or 250 (group 2, n = 8) or 500 (group 3, n = 9) or 750 (group 4, n = 9) mg/kg OEO in a completely randomized design for 16 week. Theresults showed that the percentage of sperm with distal cytoplasmic droplet in group 3 was signifcantly lower than that in groups 1 over time (P＜0.01). Ⅰn addition, group 3 had greatest percentage normal morphology of sperm at 16 week (P＜0.01) than group 1 and 4. Throughout experimental period, group 2, 3 and 4 resulted in a increase in the superoxide dismutase (SOD) activity of seminal plasma than that in group 1 (P＜0.05). Group 2 and 3 had greater sperm viability than group 4 at week 12, moreover, group 3 had greater sperm viability and membrane potential (MMP) than group 1 and 4 at week 16 (P＜0.05). These results indicated that OEO dietary supplementation promoted antioxidant capacity in boars, and inclusion of 500 mg/kg OEO into the strengthened fsh oil diet positively afect boar sperm membrane function and morphology.

Boars; Oregano essential oil; Sperm morphology; Sperm membrane; Antioxidant status

S828.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-01-085

2016-05-07；

2016-07-29

國家科技支撐計劃（2014BAD20B01）；湖北省農(nóng)業(yè)創(chuàng)新崗位（2007-620）；湖北省自然科學(xué)基金（2013CFA010）；自主科技創(chuàng)新基金培育專項（2662015PY014）

劉慶（1984 -），男，山西忻州人，博士，主要從事動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)研究，E -mail: liubai126111@163.com

*通訊作者: 彭健，教授，博士生導(dǎo)師，E- mail: pengjian@ mail.hzau.edu.cn