陳國福，吳麗君，張雪鵬，蔡 準(zhǔn)，孟祥潮

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科，唐山 063000)

ADAM17-shRNA在缺氧條件下對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的影響*

陳國福，吳麗君，張雪鵬△，蔡 準(zhǔn)，孟祥潮

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科，唐山 063000)

目的 研究在缺氧環(huán)境下靶向針對(duì)解聚素-金屬蛋白酶17(ADAM17)的短發(fā)夾狀RNA(shRNA)對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響。方法 針對(duì)ADAM17設(shè)計(jì)4個(gè)特異性的ADAM17-shRNA，經(jīng)電穿孔法轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞。缺氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞。試驗(yàn)分為：對(duì)照組(空白磷酸鹽緩沖液)、無義序列組(轉(zhuǎn)染無義序列ADAM17-shRNA)和shRNA轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染ADAM17-shRNA，選擇沉默ADAM17基因效率最高的shRNA用于后續(xù)試驗(yàn))。分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、iCELLigence、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞ADAM17mRNA的表達(dá)水平、細(xì)胞增殖活性和細(xì)胞周期變化。結(jié)果 4個(gè)shRNA轉(zhuǎn)染組對(duì)MCF-7細(xì)胞的ADAM17基因表達(dá)均有沉默作用，與對(duì)照組及無義序列組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，尤以shRNA1219抑制率最高(F=5.11,P<0.01)。shRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞生長速度和增殖活性較對(duì)照組和無義序列組顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。shRNA轉(zhuǎn)染組的絕大多數(shù)細(xì)胞停留在G0/G1期(73.35±2.45)，與對(duì)照組(62.56±2.35)、無義序列組(62.68±1.20)相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，細(xì)胞周期進(jìn)展明顯延緩。結(jié)論ADAM17-shRNA在缺氧條件下抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖。

RNA；聚合酶鏈反應(yīng)；缺氧；解聚素-金屬蛋白酶17；RNA干擾；增殖

當(dāng)今乳腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，成為威脅女性健康的重要惡性腫瘤。對(duì)乳腺癌的病因?qū)W及發(fā)病機(jī)制的研究成為熱點(diǎn)。解聚素-金屬蛋白酶17(ADAM17)是解聚素-金屬蛋白酶家族的重要成員之一。具有解聚素和金屬蛋白酶的活性。近年來ADAM17在乳腺癌中的作用也越來越被關(guān)注。課題組前期研究提示ADAM17在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展的整個(gè)進(jìn)程中起到了極其重要的作用[1]。然而腫瘤組織在快速增長過程中，必然會(huì)造成局部組織缺氧，缺氧對(duì)腫瘤的生長、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲等發(fā)揮重要且復(fù)雜的作用。研究已證實(shí)缺氧是乳腺癌等實(shí)體腫瘤物理微環(huán)境的基本特征之一[2]。本研究通過在缺氧條件下利用RNA干擾技術(shù)靶向針對(duì)ADAM17基因的短發(fā)夾RNA對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響，從而揭示缺氧條件下ADAM17與腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞由華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供；Trizol、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PIatimum SYBR PCR試劑盒均由Invitrogen公司提供；ADAM17-shRNA和ADAM17-shNC載體購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，每個(gè)載體均包含綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)框架，根據(jù)綠色熒光蛋白的表達(dá)情況來確定轉(zhuǎn)染效率。靶序列見表1。

表1 ADAM17的不同靶序列

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人乳腺癌MCF-7細(xì)胞用含有10%胎牛血清，1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫，沖入含1%O2、5%CO2、94%N2的混合氣體賽默Thermo3131三氣水套式培養(yǎng)箱下行缺氧環(huán)境培養(yǎng)。

1.2.2 電穿孔法轉(zhuǎn)染 收集細(xì)胞，吸取20 μL Opti-MEM Ⅰ懸浮細(xì)胞1×106，每個(gè)電擊杯中添加5 μL的ADAM17-shRNA表達(dá)載體，加入質(zhì)粒。充分混勻細(xì)胞，上機(jī)操作。設(shè)置CUY21 EDIT Ⅱ細(xì)胞電轉(zhuǎn)化儀的輸出電壓(125 V)、脈沖寬度(10 ms)和電轉(zhuǎn)時(shí)間(1 min)，電處理結(jié)束后，加入完全培養(yǎng)液。試驗(yàn)分為對(duì)照組、shRNA轉(zhuǎn)染組和無義序列組，同樣采用電穿孔法轉(zhuǎn)染對(duì)照組和無義序列組，對(duì)照組加入與轉(zhuǎn)染試劑和ADAM17-shRNA載體混合總量等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)；無義序列組加入等量的轉(zhuǎn)染試劑和無義序列ADAM17-shNC載體。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測(cè)細(xì)胞的ADAM17基因表達(dá) 轉(zhuǎn)染成功后12～24 h，缺氧條件下培養(yǎng)24～48 h后，收集各組細(xì)胞，經(jīng)Trizol試劑說明書一步法提取總RNA，測(cè)定總RNA的純度和濃度符合試驗(yàn)要求后采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，PIatimum SYBR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，根據(jù)ADAM17引物序列：上游5′-ATC AAA CCC TTT CCT GCG-3′，下游5′-CAA ACC CAT CCT CGT CCA-3′，擴(kuò)增片段154 bp；β-actin內(nèi)參引物序列：上游5′-GTC ACC TTC ACC GTT CCA GTT TT-3′，下游5′-TTC TTT CCC ACA TTG CGT TGA TTC-3′，擴(kuò)增片段175 bp；并通過檢測(cè)轉(zhuǎn)染ADAM17 mRNA的表達(dá)情況，篩選出抑制ADAM17 mRNA 最高的shRNA，用于后續(xù)試驗(yàn)。對(duì) Real-time PCR的結(jié)果采用相對(duì)定量的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 iCELLigence檢測(cè)細(xì)胞的增殖曲線 細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染后，使用iCELLigence系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，取出E-Plate L8，在孔中加入300 μL混合均勻的3組細(xì)胞懸液，放到三氣水套式培養(yǎng)箱中的iCELLigence上行缺氧培養(yǎng)。采用iCELLigence系統(tǒng)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞的生長和增殖過程，系統(tǒng)傳感器檢測(cè)獲得的細(xì)胞阻抗參數(shù)-細(xì)胞指數(shù)(CI)，應(yīng)用iCelligence DA Software 2.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和圖像處理。

1.2.5 流式細(xì)胞技術(shù)儀分析細(xì)胞周期 轉(zhuǎn)染后，缺氧條件下培養(yǎng)24 h后，收集各組細(xì)胞懸液，加入預(yù)冷的70%乙醇2 mL充分懸浮細(xì)胞，置于4 ℃固定細(xì)胞24 h以上。細(xì)胞固定好后，加入濃度為50 μg/mL的碘化丙啶(PI)500 μL，常溫下避光染色30 min。用鉬濾網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，采用標(biāo)準(zhǔn)程序經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1shRNA載體轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞的效率評(píng)價(jià)shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后，連續(xù)培養(yǎng)48h后置于熒光倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果表明電穿孔轉(zhuǎn)染法的效率高達(dá)95%以上，見圖1。

A：轉(zhuǎn)染shRNA熒光圖像；B：轉(zhuǎn)染shRNA明場(chǎng)圖像；C：A和B的疊加圖像。

圖1 熒光倒置相差顯微鏡下觀察電穿孔法轉(zhuǎn)染效率(×100)

2.2ADAM17mRNA表達(dá)的水平 無義序列組(2-△△CT=0.97±0.14)與對(duì)照組比較，ADAM17mRNA的表達(dá)無明顯變化，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組及無義序列組相比，shRNA轉(zhuǎn)染組的4個(gè)序列中ADAM17mRNA表達(dá)水平均(轉(zhuǎn)染shRNA-297，2-△△CT=0.76±0.08；轉(zhuǎn)染shRNA-1134，2-△△CT=0.59±0.15；轉(zhuǎn)染shRNA-1219，2-△△CT=0.52±0.09；轉(zhuǎn)染shRNA-1508，2-△△CT=0.52±0.21)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，尤以shRNA1219抑制率最高(F=5.11,P<0.01)，用于后續(xù)試驗(yàn)。在缺氧條件下特異性的ADAM17-shRNA表達(dá)載體可顯著地抑制ADAM17mRNA的表達(dá)。

2.3 細(xì)胞生長曲線和增殖活性 經(jīng)iCelligenceDASoftware1.0軟件處理分析后得到細(xì)胞生長曲線，并測(cè)得對(duì)照組、無義序列組和shRNA轉(zhuǎn)染組的CI分別為2.86、2.73和1.27。無義序列組和對(duì)照組的MCF-7細(xì)胞的生長速度和增殖活性無明顯變化(P>0.05)；但與對(duì)照組與無義序列組相比較，shRNA轉(zhuǎn)染組的MCF-7細(xì)胞的生長速度減慢，增殖活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.4 細(xì)胞周期的變化 流式細(xì)胞儀檢測(cè)shRNA轉(zhuǎn)染組處于G0/G1期的細(xì)胞比例顯著高于無義序列組和對(duì)照組，處于S期和G2/M期的細(xì)胞比例均顯著低于無義序列組和對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組和無義序列組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3、表2。

圖2 各組細(xì)胞的生長曲線

A：對(duì)照組；B：無義序列組；C：shRNA轉(zhuǎn)染組。

圖3 各組細(xì)胞的流式細(xì)胞周期圖表2 各組細(xì)胞周期的各期的情況

a：P<0.05，與shRNA轉(zhuǎn)染組比較。

3 討 論

ADAM17是解聚素-金屬蛋白酶家族的重要成員之一，具有解聚素和金屬蛋白酶的活性，ADAM17發(fā)揮蛋白剪切酶樣的作用，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移運(yùn)動(dòng)等多種生物學(xué)行為[3-4]。目前研究發(fā)現(xiàn)ADAM17在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展的過程中扮演著很重要的角色。Giricz等[5]研究發(fā)現(xiàn)ADAM17可以通過EGFR-PI3K-AKT信號(hào)通路途徑，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。Sternlicht等[6]報(bào)道ADAM17可通過激活雙調(diào)蛋白來促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。原慶會(huì)等[7]發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中ADAM17mRNA和蛋白水平與臨床病理分期密切相關(guān)，ADAM17蛋白水平與TNM分期呈正相關(guān)。Narita等[8]研究發(fā)現(xiàn)ADAM17在乳腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，并且隨組織的惡性程度、臨床分期的增加和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而表達(dá)增高。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)表現(xiàn)為雙鏈RNA以序列特異性的方式來沉默內(nèi)源性基因的表達(dá)。目前大多數(shù)siRNA表達(dá)載體被設(shè)計(jì)成能表達(dá)短發(fā)夾狀RNA(shRNA)，從而使得shRNA在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，隨后在體內(nèi)加工生成siRNA，進(jìn)一步發(fā)揮基因沉默的作用。本研究首先針對(duì)ADAM17設(shè)計(jì)合成具有特異性的ADAM17-shRNA，經(jīng)電轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率高達(dá)90%以上。試驗(yàn)結(jié)果說明shRNA的4個(gè)轉(zhuǎn)染組中ADAM17mRNA的表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)；shRNA轉(zhuǎn)染組的MCF-7細(xì)胞生長速度和增殖活性顯著降低(P<0.05)；shRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞周期進(jìn)展延緩。彭曉兵等[9]研究發(fā)現(xiàn)ADAM17-shRNA轉(zhuǎn)染的SD大鼠BMSC對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖能力有顯著的抑制作用。丁華等[10]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ADAM17-shRNA的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)MCF-7細(xì)胞ADAM17mRNA的表達(dá)有顯著抑制作用，對(duì)細(xì)胞的體外侵襲能力也有明顯抑制作用。說明靶向針對(duì)ADAM17基因的shRNA可以有效抑制MCF-7細(xì)胞ADAM17mRNA的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖，延緩細(xì)胞周期的進(jìn)展。

同時(shí)，腫瘤細(xì)胞的生長還需考慮腫瘤內(nèi)部的缺氧微環(huán)境對(duì)腫瘤形成、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移等的影響作用。惡性腫瘤快速增長，從而使它對(duì)氧的需求量增加；另外，一部分腫瘤組織逐漸遠(yuǎn)離具有豐富營養(yǎng)來源的血管而出現(xiàn)腫瘤血供不足，導(dǎo)致這一部分腫瘤組織缺氧壞死。趙婷婷等[11]發(fā)現(xiàn)缺氧降低乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖能力，增加其侵襲、轉(zhuǎn)移能力，但并沒有闡明其作用機(jī)制。楊雪飛等[12]研究發(fā)現(xiàn)缺氧可以導(dǎo)致人非小細(xì)胞肺癌A549系凋亡,但能增加存活細(xì)胞的侵襲能力。

目前模擬細(xì)胞缺氧環(huán)境主要有兩種方式：化學(xué)缺氧法和物理缺氧法。本試驗(yàn)采用物理缺氧法，充入含1%的O2、5%的CO2、94%的N2的賽默Thermo3131三氣水套式培養(yǎng)箱來模擬腫瘤細(xì)胞的體外缺氧微環(huán)境，更近似體內(nèi)腫瘤缺氧微環(huán)境來研究缺氧對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響。本試驗(yàn)在缺氧條件下研究靶向針對(duì)ADAM17基因的shRNA對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果同樣說明ADAM17-shRNA在缺氧條件下對(duì)MCF-7細(xì)胞的ADAM17基因具有沉默作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞的生長速度和增殖活性降低，細(xì)胞周期進(jìn)展延緩，抑制了細(xì)胞增殖。同樣與本研究結(jié)果相似，張博等[13]發(fā)現(xiàn)缺氧條件下通過上調(diào)miRNA-21多個(gè)信號(hào)通路靶基因，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡率增加。王晗等[14]研究發(fā)現(xiàn)RNA干擾沉默缺氧誘導(dǎo)因子-1α能夠促進(jìn)MCF-7凋亡,下調(diào)VEGF表達(dá),推遲細(xì)胞周期。ADAM17在乳腺癌的形成和發(fā)展的過程中起到重要的作用，因此以ADAM17作為治療乳腺癌藥物研究的一個(gè)靶點(diǎn)，在缺氧環(huán)境下利用RNA干擾技術(shù)的優(yōu)勢(shì)進(jìn)行抗腫瘤藥物的研究，是對(duì)現(xiàn)有乳腺癌基因靶向治療起到重要的補(bǔ)充和完善作用。因此，該試驗(yàn)研究將能夠進(jìn)一步地為乳腺癌的靶向治療領(lǐng)域提供新的研究方向。

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Effect of ADAM17-shRNA on proliferation of human breast cancer cell line MCF-7 in hypoxia*

ChenGuofu,WuLijun,ZhangXuepeng△,CaiZhun,MengXiangchao

(DepartmentofSurgicalOncology,AffiliatedHospital,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan,Hebei063000,China)

Objective To investigate the effects of shRNA targeting a disintegrin and metalloproteinases 17( ADAM17) on the proliferation of human breast cancer MCF-7 cells in hypoxia environment.Methods The four specific ADAM17-shRNA sequences aiming at ADAM17 were designed,transfected into MCF-7 cells by electroporation,and cultured in hypoxia environment.The experiment was divided into the control group (blank phosphate buffer solution,PBS),nonsense sequence group (transfected with ADAM17-shNC) and shRNA transfection group (transfected with ADAM17-shRNA,the highest silencing efficiency of shRNA was selected for following experiments).Real-time PCR was used to detect the expression of ADAM17 mRNA.The proliferation ability and cell cycle change of MCF-7 cells were detected by iCELLigence and flow cytometry (FCM),respectively.Results Compared with control group and nonsense sequence group,the four ADAM17-shRNA transfection groups all had the silence effect on ADAM17 gene expression (P<0.05),the difference was statistically significant(P<0.05),particularly shRNA1219 had the highest inhibitory rate (F=5.11,P<0.01).The cellular proliferation ability and cell growth speed in the shRNA transfection group were significantly decreased compared with the control group and nonsense sequence group (P<0.05).Most cells of shRNA transfection group remained in the G0/G1phase (73.35±2.45),which in the control group and nonsense sequence group was (62.56±2.35) and (62.68±1.20) respectively,the difference was statistically significant(P<0.05).The cell cycle progression was significantly delayed.Conclusion ADAM17-shRNA inhibits the proliferation of MCF-7 cells under hypoxic environment.

RNA；polymerase chain reaction ；hypoxia;depolymerization metalloproteinases 17;RNAi;proliferation

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.01.004

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(C2010001767)；唐山市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(14130256B)。

陳國福(1989-),在讀碩士，主要從事乳腺癌的基礎(chǔ)與臨床方面研究?！?/p>

E-mail:syzxp@sina.com。

R

A

1671-8348(2017)01-0029-04

2016-07-18

2016-09-08)