權(quán) 哲，宋 薇，韋 博，胡國章

(1.上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院 神經(jīng)二科，上海201400；吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 2.急診科；3.神經(jīng)外二科)

纖維蛋白膠介導(dǎo)大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞移植干預(yù)大鼠急性腦缺血的實(shí)驗(yàn)研究

權(quán) 哲1，宋 薇2*，韋 博3，胡國章2

(1.上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院 神經(jīng)二科，上海201400；吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 2.急診科；3.神經(jīng)外二科)

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

冰箱(Hisense)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Scientific)，熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS) ，電熱恒溫干燥箱(常州潤華儀器)，超純水純化儀(四川優(yōu)普科技)，高壓蒸汽滅菌鍋(山東博科)，動(dòng)物大腦立體定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。M199培養(yǎng)基(Life公司)，胎牛血清(BI)，大鼠淋巴細(xì)胞分離液(上海生工生物)，纖維蛋白膠(sigma公司)，CD34/CD133熒光標(biāo)記的抗體(BD公司)，VEGF/FGF-2單克隆抗體(Bioworld公司)。

1.2 大鼠骨髓 EPCs的分離、培養(yǎng)和鑒定

將健康 Wistar 大鼠用乙醚麻醉后脫臼處死，75%酒精中浸泡5 min，超凈臺(tái)內(nèi)剝離肌肉并離斷兩端骨骺，預(yù)冷PBS潤洗，加入淋巴細(xì)胞分離液離心后收集沉淀，用M199培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)后接種到24孔板中，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。CD34/CD133陽性的細(xì)胞通過免疫熒光鑒定獲得。

1.3 內(nèi)皮祖細(xì)胞與纖維蛋白膠形成復(fù)合物

將適量的CD34/CD133陽性內(nèi)皮祖細(xì)胞用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基重懸后，種植在纖維蛋白膠表面，定期更換新的培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，大約經(jīng)過7 d后形成載有內(nèi)皮祖細(xì)胞的纖維蛋白膠復(fù)合物。

1.4 大鼠急性腦卒中模型的建立

式中：Eb為泵站運(yùn)行費(fèi)用，元/m3；W 為泵站裝機(jī)功率，kW；F為農(nóng)業(yè)供水電價(jià)，元/（kW·h）；Q 為泵站設(shè)計(jì)流量，m3/h；η末為泵站出口 （一級計(jì)量點(diǎn)）至終端計(jì)量點(diǎn)之間的渠系水利用系數(shù)，示范區(qū)中為斗渠渠道水利用系數(shù)。

將30只SD大鼠隨機(jī)均分為3組：假手術(shù)組(A組，n=10)，對照組(B組，n=10，單獨(dú)移植大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞)，實(shí)驗(yàn)組(C組，n=10，移植大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞-纖維蛋白膠復(fù)合物)。利用酒精消毒后的線栓制備大鼠急性腦缺血模型，假手術(shù)組除線栓處理外，其它操作均同手術(shù)組。

1.5 腦卒中模型的評定指標(biāo)

1.5.1 行為學(xué)評定標(biāo)準(zhǔn)[6](見表1)

表1 神經(jīng)功能評定標(biāo)準(zhǔn)

評分1分以上認(rèn)為模型成功，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.5.2 TTC染色評定 利用水合氯醛腹腔麻醉大鼠，快速斷頭取腦，將鼠腦平分為厚約3 mm的切片，按順序浸入1%TTC中，37℃染色30 min，正常腦組織TTC染色為鮮紅色，缺血區(qū)腦組織為白色，計(jì)算每組大鼠的腦梗死面積。

1.5.3 病理及免疫組化評定 在移植后不同時(shí)間點(diǎn)，將各組大鼠的腦組織浸入4%多聚甲醛中，切除小腦與延髓，平均切成等厚度的6個(gè)冠狀切片，石蠟包埋后進(jìn)行HE染色，觀察腦組織病理學(xué)變化；同時(shí)進(jìn)行VEGF、FGF-2免疫組化，每張切片取8個(gè)不重復(fù)視野，計(jì)數(shù)VEGF、FGF-2的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均獨(dú)立重復(fù)檢測3次，使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料比較采用t2檢驗(yàn)，多個(gè)樣本的組間比較采用ANOVA，對因素分析采用多元線性回歸分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞的鑒定

內(nèi)皮祖細(xì)胞表面特異性標(biāo)志有CD133、CD34等，對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行CD133、CD34免疫熒光檢測，結(jié)果顯示收集的細(xì)胞均為CD133、CD34表達(dá)陽性(見圖1)。

圖1-1 EPCs CD133+

圖1-2 EPCs CD34+

2.2 各組大鼠的行為學(xué)評分

在3 d、7 d、14 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對各組大鼠的行為學(xué)進(jìn)行評分，移植術(shù)3 d后，B、C兩組間評分無顯著性差異(P>0.05)，但均顯著高于A組(P<0.01)；移植后7 d，C組評分顯著低于B組(P<0.05)，移植14 d后兩組評分差異更明顯(P<0.01)。見表2。

表2 三組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的行為學(xué)評分(n=10)

假手術(shù)A與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，與對照組B組比較，#P<0.05,##P<0.01。

2.3 TTC染色評定各組大鼠的腦梗死面積

TTC染色評定3 d、7 d、14 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腦梗死面積，移植術(shù)3 d后，三組間腦梗死面積無顯著性差異(P>0.05)；移植后7 d，C組腦梗死面積顯著低于B組(P<0.05)，移植14 d后兩組腦梗死面積差異更明顯(P<0.01)。組內(nèi)相比，隨著移植時(shí)間的延長，A組大鼠的腦梗死面積逐漸增大，B、C兩組大鼠的腦梗死面積逐漸減小，C組大鼠降低更為明顯。見表3。

表3 三組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的腦梗死面積(n=10)

組間比較，*P<0.05，**P<0.01；組內(nèi)比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.4 HE染色檢測各組大鼠的病理學(xué)變化

HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)A組大鼠神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)幾乎無變化，胞漿無紅染，B和C組大腦組織的壞死區(qū)域均發(fā)現(xiàn)缺失大量神經(jīng)元，膠質(zhì)細(xì)胞異常增生，隨著移植時(shí)間的延長，B組大鼠腦梗死周圍未出現(xiàn)新生的毛細(xì)血管，C組大鼠腦組織梗死體積明顯減少，且腦梗死區(qū)域周圍可見大量新生的毛細(xì)血管。

2.5 各組大鼠腦組織VEGF、FGF-2免疫組化

VEGF、FGF-2免疫組化的著色部位主要在胞漿，呈黃褐色或棕黃色。A組大鼠腦組織的VEGF、FGF-2主要表達(dá)在少量的血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)無明顯變化。B、C組在腦缺血區(qū)域中的血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)明顯增多，均在移植后7d陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)到峰值，但C組大鼠腦組織VEGF、FGF-2的表達(dá)量在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯高于B組(P<0.05)和A組(P<0.01)。見表4。

表4 三組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的VEGF、FGF-2陽性細(xì)胞數(shù)(n=10)

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 結(jié)論

腦卒中[7](又稱腦中風(fēng))是世界上最重要的致死性疾病之一，具有極高的病死率和致殘率，但由于藥物治療的療效欠佳，手術(shù)治療又受到各種條件的限制，急需尋求新的治療手段[8]。自從在外周血中發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)，大量研究發(fā)現(xiàn)EPCs具有修復(fù)血管損傷、促進(jìn)神經(jīng)纖維的生長和神經(jīng)功能恢復(fù)等功能，不僅更新了傳統(tǒng)上關(guān)于血管損傷后修復(fù)的理論，而且為防止血管再狹窄、腦血管疾病和血管創(chuàng)傷愈合治療提供了廣泛的臨床應(yīng)用前景[9]。但由于體內(nèi)EPCs的數(shù)量有限，不能充分滿足細(xì)胞組織工程的迫切需要，如何快速穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增EPCs是一個(gè)困擾廣大研究者的問題[10]。而目前仍無一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方案規(guī)范對大鼠外周血中的EPCs誘導(dǎo)培養(yǎng)，本實(shí)驗(yàn)通過查閱大量國內(nèi)外文獻(xiàn)[11]，并經(jīng)過前期實(shí)驗(yàn)條件的反復(fù)摸索，最后借助免疫熒光技術(shù)，成功分離得到能在體外穩(wěn)定傳代的內(nèi)皮祖細(xì)胞，為EPCs在體內(nèi)的移植提供可靠的理論基礎(chǔ)。

伴隨細(xì)胞移植工程的研究，生物活性材料也是近年來快速發(fā)展的熱門研究領(lǐng)域。有文獻(xiàn)報(bào)道，將生物材料單獨(dú)應(yīng)用或結(jié)合細(xì)胞，能夠明顯改善心梗后的心肌不良重構(gòu)。生物材料的選擇具有嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)[12]，一方面需要生物可降解性和適當(dāng)?shù)奈锢韽?qiáng)度，另一方面要具備膠原、纖連蛋白和層粘連蛋白的生物學(xué)特性。纖維蛋白膠是經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)的作為血和粘合劑廣泛應(yīng)用的生物材料，不僅能為傷口內(nèi)細(xì)胞的生長提供細(xì)胞間質(zhì)，而且通過促進(jìn)成肌細(xì)胞移植物的生存和保持，減少梗死范圍，并成功誘導(dǎo)梗死區(qū)的血管新生。本實(shí)驗(yàn)采用TTC染色法對各組大鼠的腦組織進(jìn)行染色，比較不同方式移植后大鼠腦梗死面積的變化，發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)移植EPCs相比，利用纖維蛋白膠介導(dǎo)EPCs的移植，能明顯降低大鼠的腦梗死面積，同時(shí)HE染色結(jié)果顯示纖維蛋白膠介導(dǎo)EPCs的移植能顯著促進(jìn)大鼠腦卒中周圍的血管新生，改善腦卒中大鼠的病理學(xué)變化進(jìn)程，提示纖維蛋白膠可以作為有效的生物活性材料，介導(dǎo)EPCs移植體內(nèi)后發(fā)揮生物學(xué)功能。

VEGF 是一類促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的關(guān)鍵因子[13]，體外能特異性結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞，刺激內(nèi)皮細(xì)胞的分裂增殖，體內(nèi)可有效促進(jìn)形成新生血管，能起到對神經(jīng)系統(tǒng)直接的保護(hù)作用[14]。FGF-2是一類具有血管活性和神經(jīng)營養(yǎng)功能的因子，在人體的神經(jīng)系統(tǒng)和心、腎、肝等組織中廣泛分布，研究表明[15]FGF-2的上調(diào)表達(dá)有助于腦缺血后的神經(jīng)保護(hù)。本實(shí)驗(yàn)將EPCs單獨(dú)或結(jié)合纖維蛋白膠移植入大鼠的急性腦卒中模型，在不同時(shí)間點(diǎn)檢測VEGF和FGF-2的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)兩種指標(biāo)在A組大鼠的腦組織神經(jīng)細(xì)胞中均為少量表達(dá)，B、C兩組大鼠的表達(dá)水平均增加，且顯著高于A組，并在移植7 d后達(dá)到最大值，但C組大鼠腦組織VEGF、FGF-2的表達(dá)量在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯高于B組和A組。提示EPCs移植后能促進(jìn)腦組織中神經(jīng)細(xì)胞分泌VEGF和FGF-2，進(jìn)而促進(jìn)血管新生和神經(jīng)功能的恢復(fù)，而結(jié)合纖維蛋白膠后，進(jìn)一步加強(qiáng)治療效果。

本課題通過從大鼠骨髓中成功分離收集EPCs，并結(jié)合纖維蛋白膠進(jìn)行移植，發(fā)現(xiàn)對治療大鼠急性腦卒中有更好的療效，為臨床治療血管新生相關(guān)疾病提供了新的指導(dǎo)。

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1007-4287(2017)01-0145-04

上海市奉賢區(qū)區(qū)科委課題：2015-1003

權(quán) 哲(1976-)，男，副主任醫(yī)師，博士。

2016-03-10)

*通訊作者