谷 洋，劉志毅，金 虎，劉 明，孫鐵梁

(吉林大學(xué)第四醫(yī)院 普通外科，吉林 長(zhǎng)春130011)

pAdKDR/CD/TK雙自殺基因系統(tǒng)對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用的試驗(yàn)研究

谷 洋，劉志毅*，金 虎，劉 明，孫鐵梁

(吉林大學(xué)第四醫(yī)院 普通外科，吉林 長(zhǎng)春130011)

目的 探討含KDR啟動(dòng)子的雙自殺基因CD/TK對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的殺傷作用。方法 觀察不同前藥對(duì)HepG2細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304和LST174細(xì)胞的殺傷作用，評(píng)估KDR啟動(dòng)子的靶向殺傷作用。觀察不同前藥對(duì)轉(zhuǎn)染不同自殺基因的HepG2細(xì)胞的殺傷作用，及旁觀者效應(yīng)。結(jié)果 轉(zhuǎn)染腺病毒的HepG2細(xì)胞及血管內(nèi)皮ECV304細(xì)胞對(duì)前藥具有較高的敏感性，而感染腺病毒的LST174細(xì)胞對(duì)前藥不敏感(P<0.05)。當(dāng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞混合比例為50%時(shí)，應(yīng)用前藥后，轉(zhuǎn)染CD/TK,CD,TK的HepG2細(xì)胞生存率分別為11.8±1.2%、41.3±3.7%、43.1±2.3%(P<0.05)。結(jié)論 含KDR啟動(dòng)子的雙自殺基因CD/TK對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞具有高度靶向殺傷作用；聯(lián)合用藥對(duì)轉(zhuǎn)染雙自殺基因的肝癌HepG2細(xì)胞具有協(xié)調(diào)增強(qiáng)殺傷作用。

雙自殺基因； KDR啟動(dòng)子；肝癌細(xì)胞;基因

(ChinJLabDiagn,2017,21:0132)

肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，惡性程度高，外科手術(shù)治療效果差。近年來(lái)，隨著基因治療腫瘤的深入研究，自殺基因治療腫瘤成為研究熱點(diǎn)，雙自殺基因能夠產(chǎn)生兩種基因的互補(bǔ)增效的作用，我們聯(lián)合應(yīng)用TK/GCV,CD/5-FC，研究KDR啟動(dòng)的雙自殺基因系統(tǒng)對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重組腺病毒(吉林大學(xué))，肝癌細(xì)胞HepG2(北京細(xì)胞研究所)，轉(zhuǎn)染試劑PolyFect (Qiagen 公司) GCV (Roche Pharma 公司) DMEM、RPMI 1640、MTT、小牛血清( Gibco 公司),5-FC(Sigma 公司)。

1.2 HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)

①10 ml PRMI1640細(xì)胞生長(zhǎng)液，37℃水浴，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇浸泡去除污染。將細(xì)胞懸液離心(200×g)，5 min，加入5 ml新鮮細(xì)胞生長(zhǎng)液。新鮮PRMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液10 ml，細(xì)胞懸液5 ml，37℃，5%CO2；細(xì)胞70%時(shí)行1∶3傳代。用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)10 ml清洗細(xì)胞，滅活Tyrosine，新鮮PRMI 1640細(xì)胞生長(zhǎng)液8.5 ml，新鮮PRMI 1640細(xì)胞液9 ml，細(xì)胞懸液1 ml，37℃下孵育，體積分?jǐn)?shù)5%CO2。細(xì)胞70%匯合傳代。

1.3 重組腺病毒對(duì)HepG2細(xì)胞、LST174細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304的感染率測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述三種細(xì)胞培養(yǎng)板，體積分?jǐn)?shù)5%，CO2，37℃，加入不同感染復(fù)數(shù)的目的腺病毒pAdKDR/CD/TK ，3 d后在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.4 前藥不同濃度對(duì)細(xì)胞的殺傷作用

將HepG2細(xì)胞、LST174細(xì)胞和ECV304(血管內(nèi)皮細(xì)胞)以接種培養(yǎng)板，用100M0I的重組腺病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將不同濃度的前藥GCV和5-FC加入含5%小牛血清培養(yǎng)基，設(shè)GCV組、5-FC組和GCV+5-FC組，72 h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1.5 pAdEasy-KDR-CD pAdEasy-KDR-TK pAdEasy-KDR-CD/TK重組腺病毒的轉(zhuǎn)染

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)，體積分?jǐn)?shù)5%CO2，37℃培養(yǎng)，再分別加入10 μl重組腺病毒KDR-CD KDR-TK KDR-CD/TK質(zhì)量濃度為8 μg/ml，37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.6 旁觀者效應(yīng)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞(轉(zhuǎn)基因和未轉(zhuǎn)基因)，以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，24 h后不同濃度混合，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率。

1.7 藥物濃度對(duì)腺病毒的HepG2細(xì)胞的殺傷效應(yīng)

1.7.1 將轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染pAdKDR/CD/TK HepG2細(xì)胞培養(yǎng)，加入不同濃度的前藥5-FC、GCV，設(shè)5-FC組、GCV組和GCV+5-FC組，72 h以后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1.7.2 將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)重組腺病毒感染。24 h后，加入不同濃度的5-FC 和GCV，設(shè)GCV組、5-FC組和GCV+5-FC組，72 h以后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.5軟件處理，采取單因素方差分析，組間比較用SNK法，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 重組腺病毒的酶切PCR鑒定

重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定，目的基因片段均有表達(dá)。為證實(shí)外源基因?qū)氚屑?xì)胞，應(yīng)用特異基因引物KDR、TK、CD、CD/TK分別進(jìn)行PCR片段擴(kuò)增。結(jié)果：蛋白電泳分別切出特異性片段，分別為KDR、TK、CD及TK/CD，證實(shí)目的基因片段成功導(dǎo)入HepG2細(xì)胞(圖1)。電鏡下可見(jiàn)熒光蛋白GFP的表達(dá)，說(shuō)明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞成功(圖2)。

2.2 重組腺病毒對(duì)三種細(xì)胞(HepG2,ECV304,LST174)感染率的測(cè)定

MOI=10時(shí)，觀察到含熒光的細(xì)胞比較少；MOI=100時(shí)，含熒光細(xì)胞量大于90%；MOI=200，幾乎全部為含熒光細(xì)胞，說(shuō)明隨腺病毒滴度的變化影響細(xì)胞的感染率，細(xì)胞的感染率隨滴度升高而升高，重組腺病毒對(duì)三種細(xì)胞的感染效率相似(圖3)。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)，除LST174細(xì)胞外，均檢測(cè)到目的基因的表達(dá)(圖4)。

圖1 重組KDR/CD，KDR/TK，KDR/CD/TK質(zhì)粒酶切鑒定

圖2 電鏡下可見(jiàn)熒光蛋白GFP的表達(dá)

圖3 重組腺病毒(AdKDRP-CD/TK)對(duì)三種細(xì)胞的感染率測(cè)定

圖4 感染AdKDR-CD/TK細(xì)胞的鑒定

2.3 前藥對(duì)三種細(xì)胞(HepG2，LST174，ECV304)的殺傷作用

感染腺病毒的HepG2和ECV304細(xì)胞對(duì)前藥有較高的敏感性；而LS T 174細(xì)胞對(duì)前藥敏感性較差，后者與前二者相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。顯示KDR啟動(dòng)子與MCV啟動(dòng)子一樣，具有靶向性殺傷作用。

2.4 旁觀者效應(yīng)

從結(jié)果看，旁觀者效應(yīng)明顯，隨轉(zhuǎn)基因細(xì)胞所占比例的增加旁觀者效應(yīng)隨之增強(qiáng)(圖6)。HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染TK和轉(zhuǎn)染CD的旁觀者效應(yīng)相似，轉(zhuǎn)染TK/CD基因的HepG2細(xì)胞與之比較，旁觀者效應(yīng)明顯增強(qiáng)。當(dāng)50%為轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，三者細(xì)胞生存率分別為(11.8±1.2)%、(41.3±3.7)%、(43.1±2.3)%，前者與后二者比較(P<0.05)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 藥物的不同濃度對(duì)轉(zhuǎn)染腺病毒的HepG2細(xì)胞的殺傷敏感性

2.5.1 按照生長(zhǎng)的曲線計(jì)算出IC50，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組GCV分別為50 μg/ml和720 μg/ml，敏感性升高了14.3倍；5-FC的IC50分別為450 μg/ml和14 500 μg/ml，敏感性升高了28倍。而GCV+5-FC IC50分別為GCV15 μg/ml，5-FC75 μg/ml，敏感性是單獨(dú)用藥的3.4和6.8倍，是對(duì)照組敏感性的47倍和198倍。提示雙自殺基因?qū)η八幍膮f(xié)同殺傷作用，對(duì)聯(lián)合用藥作用更加顯著(圖7)。

2.5.2 根據(jù)生長(zhǎng)曲線計(jì)算IC50，GCVIC50和5-FCIC50分別為70 μg/ml和1 000 μg/ml，GCV+5-FCIC50為20/100 μg/ml，聯(lián)合用藥分別是單獨(dú)用藥GCV的3.5倍、5-FC的10倍。提示單用GCV和單用5-FC殺傷作用較強(qiáng)。而GCV+5-FC聯(lián)合用藥則有更強(qiáng)的抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示聯(lián)合用藥有協(xié)同殺傷作用(圖8)。

圖5 前藥對(duì)三種細(xì)胞的殺傷作用

圖6 HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同基因的旁觀者效應(yīng)

圖7 不同前藥濃度對(duì)pAdKDR/CD/TKS HepG2細(xì)胞對(duì)不同前藥濃度的殺傷作用

圖8 轉(zhuǎn)染KDR-TK/CD基因的HepG2細(xì)胞對(duì)GCV/5-FC的殺傷敏感性

3 討論

3.1 KDR啟動(dòng)子的靶向作用

肝癌的生物治療是近來(lái)的研究較多的領(lǐng)域，自殺基因的治療成為研究熱點(diǎn)，但仍有一些問(wèn)題沒(méi)有解決，如表達(dá)不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)染效率偏低，殺傷效果較差，靶向性不高等。如何高效地將目的基因片段導(dǎo)入靶細(xì)胞，而獲得比較有效穩(wěn)定的表達(dá)是目前基因治療的關(guān)鍵。腺病毒載體對(duì)來(lái)源于上皮細(xì)胞具有很高的親和力，因而大部分實(shí)體腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染率較高[1，2]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的原因是因?yàn)槟[瘤生長(zhǎng)具有跟強(qiáng)的血管依賴性，新生血管為腫瘤細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的氧和養(yǎng)分，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖分裂，而使腫瘤細(xì)胞通過(guò)微循環(huán)浸潤(rùn)到周圍組織臟器[3，4]。既往對(duì)于肝癌的靶向治療研究較多的是AFP,并且證實(shí)AFP驅(qū)動(dòng)子能夠增強(qiáng)HSV-TK自殺基因系統(tǒng)對(duì)肝癌細(xì)胞的特異性殺傷作用[5]。研究表明KDR在許多惡性腫瘤組織內(nèi)有較高表達(dá)，其中包括肝癌組織。腫瘤組織的KDR主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞，胞膜和(或)胞漿，腫瘤組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖速度是正常組織的50-100倍，其表達(dá)水平隨血管內(nèi)皮細(xì)胞更新速度加快及腫瘤惡性程度升高而升高[6，7]，因此抑制AFP表達(dá)、抑制腫瘤血管生成可以大大增強(qiáng)抗腫瘤效果。有研究表明[8]構(gòu)建含有KDR啟動(dòng)子的雙自殺基因，既能殺傷腫瘤細(xì)胞本身，又能抑制血管生長(zhǎng)的雙重靶向作用。

PCR酶切方法鑒定顯示，TK/CD目的基因在HepG2 和ECV304細(xì)胞中有表達(dá)，而在LST174細(xì)胞無(wú)表達(dá)。提示KDR啟動(dòng)子特異性選擇殺傷作用及度靶向性。

3.2 雙自殺基因系統(tǒng)

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建轉(zhuǎn)染pAdKDR-TK/CD、pAdKDR-TK、pAdKDR-CD的HepG2細(xì)胞，觀察到明顯的旁觀者效應(yīng)，混合比例為50%時(shí)，細(xì)胞生存率分別為11.8±1.2%、41.3±3.7%、43.1±2.3%，提示雙自殺基因TK/CD比單自殺基因CD,TK細(xì)胞生存率明顯下降，具有更強(qiáng)的旁觀者效應(yīng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。分別給予GCV、5-FC、GCV+5-FC，根據(jù)生長(zhǎng)曲線計(jì)算IC50，觀察前藥的殺傷作用。敏感性是實(shí)驗(yàn)組單獨(dú)用藥的3.4倍和6.8倍。是對(duì)照組的47倍和198倍。結(jié)果顯示單獨(dú)用藥時(shí)，細(xì)胞生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而轉(zhuǎn)染雙自殺基因的HepG2細(xì)胞，聯(lián)合用藥分別是單獨(dú)用藥的3.5倍和10倍。前者與后二者相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)表明單獨(dú)應(yīng)用前藥時(shí)無(wú)論是GCV還是5-FC，轉(zhuǎn)染單自殺基因TK、CD和雙自殺基因TK/CD的HepG2細(xì)胞的殺傷率相似。而聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，轉(zhuǎn)染雙自殺基因的細(xì)胞比轉(zhuǎn)染單自殺基因細(xì)胞的殺傷率升高明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥抑制作用明顯增強(qiáng)。雙自殺基利用二者的作用互補(bǔ)，前藥應(yīng)用劑量減少，耐藥性降低，減少前藥的毒副作用，放大殺傷效果。加之旁觀者效應(yīng)以及KDR基因的高度選擇性，更加增強(qiáng)殺傷的效果。

本實(shí)驗(yàn)研究含KDR啟動(dòng)子的雙自殺基因?qū)epG2細(xì)胞的殺傷作用，結(jié)果提示：KDR啟動(dòng)子具有高度的靶向性，雙自殺基因比單自殺基因具有更強(qiáng)的殺傷作用，而且聯(lián)合用藥效果更好。本研究為細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)，還需進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，我們相信隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步，雙自殺基因有可能成為未來(lái)一種新的肝癌生物治療的有效方法。

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The study on killing effect of KDR promoter driving double suicide gene on human hepatic cancer HepG2 cells

GUYang,LIUZhi-yi,JINHu,etal.

(TheGeneralSurgeryDepartment,TheFourthHospitalofJilinUniversity,Changchun130011,China)

Objective To investigate the killing effect of KDR promoter driving double suicide gene on human hepatic cancer HepG2 cells.Methods To observe the killing effect of different kind of pre-drug on HepG2 cells,ECV304cells and LS174T cells,and evaluated the targeted killing effect of KDR.To observe the killing effect and standby effect of different kind of pre-drug on HepG2 cells.Results The HepG2 cells and ECV304 cells transfected with recombined adenovirus had high sensitivity to pre-drug.And the LS17T4 cells transfected with recombined adenovirus had no sensitivity to pre-drug(P<0.05).The HepG2 cells which transfected CD/TK,CD and TK genes,the survival rate of are 11.8±1.2%、41.3±3.7%、43.1±2.3% respectively(P<0.05) after using the pre-drug.Conclusion KDR promoter driving double suicide gene had high targed killing effect on human hepatic cancer HepG2 cells.There were enhanced killing effect on transfected double suicide genes of human hepatic cancer HepG2 cells when used combined pre-drugs.

Suicide Gene;KDR Promoter;Hepatic Cancer Cell;Gene

1007-4287(2017)01-0132-04

吉林省科技廳自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(201115117)

R735.7

A

2016-05-15)

*通訊作者