姚麗利，施介華，2

（1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310014；2.浙江工業(yè)大學(xué)綠色化學(xué)合成技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江杭州310014）

高效液相色譜法檢測(cè)間氨基苯磺酸和間硝基苯磺酸鈉

姚麗利1，施介華1，2

（1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310014；2.浙江工業(yè)大學(xué)綠色化學(xué)合成技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江杭州310014）

采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定間硝基苯磺酸鈉和間氨基苯磺酸?？疾炝肆鲃?dòng)相比例、流動(dòng)相pH等影響因素，并對(duì)選定的色譜條件進(jìn)行了方法學(xué)的驗(yàn)證。結(jié)果表明:使用W aters Atlantis C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5.0μm），流動(dòng)相為磷酸二氫鉀溶液:甲醇=9∶1，其中磷酸二氫鉀溶液濃度為20 mmol/L，pH為3.5，檢測(cè)波長220 nm，流速為1 m L/m in，柱溫為25℃能達(dá)到分離效果，此方法的精密度、線性和回收率均達(dá)到要求。該方法分析快速準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好。

高效液相色譜法；間氨基苯磺酸；間硝基苯磺酸鈉

間氨基苯磺酸是一種重要的化工中間體，在偶氮染料、醫(yī)藥、農(nóng)藥、顯影劑等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1-4]。間氨基苯磺酸的傳統(tǒng)制備方法是采用鐵粉還原間硝基苯磺酸鈉，并酸化得到的，但該方法生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量廢酸，污染嚴(yán)重[5，7]。另外還可以采用電化學(xué)法合成[6-7]，只是耗電量很大、成本過高。而在文獻(xiàn)中也有許多使用金屬催化劑催化加氫制備間氨基苯磺酸的報(bào)道[7-9]，此方法不僅符合綠色生產(chǎn)的要求，且產(chǎn)品質(zhì)量好。傳統(tǒng)上分析間氨基苯磺酸純度是測(cè)定氨基值，此方法滴定過程繁瑣，且準(zhǔn)確性差。白雪松等[10]用四乙基溴化銨做離子對(duì)色譜分析間氨基苯磺酸及雜質(zhì)。

本文使用Waters 2695-2996高效液相色譜儀，在WatersAtlantisC18色譜柱（4.6mm×150mm，5.0μm）上，流動(dòng)相為磷酸二氫鉀溶液:甲醇=9∶1，其中磷酸二氫鉀溶液濃度為20 mmol/L，pH為3.5，檢測(cè)波長220 nm，流速為1 mL/min，柱溫為25℃，在此條件下，能很好地分離間硝基苯磺酸鈉和間氨基苯磺酸以及雜質(zhì)，并對(duì)此色譜條件進(jìn)行方法學(xué)的驗(yàn)證，精密度、線性和回收率均達(dá)到要求。此方法分離效能高，分析快速準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，測(cè)定結(jié)果令人滿意。適用于間氨基苯磺酸生產(chǎn)過程的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及產(chǎn)品質(zhì)量控制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Alliance 2695型高效液相色譜儀，配2996二極管陣列檢測(cè)器和Empower色譜工作站（美國Waters公司）；Waters Atlantis C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5.0μm）（美國Waters公司）；AL-204電子天平（TETTLER TOLEDO）；PS-10A超聲波清洗機(jī)（潔康公司）；pHS-4型酸度計(jì)（杭州亞美電子儀器廠）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵；1810B自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海玻璃儀器廠）。間硝基苯磺酸鈉（Aladdin industrial corporation）；間氨基苯磺酸（Aladdin industrial corporation）；磷酸二氫鉀（湖州化學(xué)試劑有限公司），甲醇（天津四友）；二次蒸餾水。

1.2 溶液配制

磷酸二氫鉀溶液：稱取磷酸二氫鉀2.7218 g，超聲溶解，轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，用雙蒸水定容至刻度，配成20mmol/L的磷酸二氫鉀溶液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的磷酸溶液調(diào)節(jié)至所需pH，過濾后待用。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱取100 mg間硝基苯磺酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品和間氨基苯磺酸標(biāo)準(zhǔn)品，置于100m L容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容，充分搖勻，配成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

樣品溶液：用移液管量取1 mL反應(yīng)液于100mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，充分搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾后待用。

1.3 色譜條件

色譜柱：Waters Atlantis C18柱（4.6 mm×150 mm，5.0μm）；流動(dòng)相：20mmol/L磷酸二氫鉀溶液:甲醇=9:1（其中磷酸二氫鉀溶液的pH為3.5）；進(jìn)樣量：10μL；流速：1 m L/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長：220 nm。

圖1 間氨基苯磺酸（a），間硝基苯磺酸鈉（b）及雜質(zhì)（c）的紫外吸收光譜圖Figure 1 Ultraviolet absorption spectrum of 3-aminobenzenesulfonic acid（a），sodium 3-nitrobenzenesulfonate（b）and impurity（c）

2 結(jié)果和討論

2.1 色譜分離條件的選擇

2.1.1 波長的選擇

在實(shí)驗(yàn)過程中作者發(fā)現(xiàn)間硝基苯磺酸鈉和間氨基苯磺酸的保留時(shí)間相差比較大，分離度較好，能實(shí)現(xiàn)較好的分離。其中間氨基苯磺酸的保留時(shí)間較短，同時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)了一個(gè)雜質(zhì)，其保留時(shí)間與間氨基苯磺酸接近，甚至在某些色譜條件下，雜質(zhì)并不能被檢出，所以選擇波長需要考慮間硝基苯磺酸鈉、間氨基苯磺酸和雜質(zhì)能同時(shí)被檢出。圖1是間氨基苯磺酸，間硝基苯磺酸鈉及雜質(zhì)的紫外吸收光譜圖。從圖1可見，三者的最大吸收波長差異較大。雜質(zhì)的最大吸收波長為248 nm，間氨基苯磺酸的最大吸收波長為237 nm，間氨基苯磺酸的最大吸收波長為260 nm，為了提高間氨基苯磺酸和間硝基苯磺酸鈉的檢測(cè)靈敏度，且為了得到的峰型良好，選擇末端吸收的220 nm為檢測(cè)波長。

2.1.2 流動(dòng)相比例的選擇

表1是磷酸二氫鉀溶液和甲醇比例變化對(duì)間氨基苯磺酸和間硝基苯磺酸鈉保留行為的影響。從表1中可見，間氨基苯磺酸保留時(shí)間較短，保留較弱，且隨著流動(dòng)相中磷酸二氫鉀溶液和甲醇比例變化，其保留時(shí)間變化不是很大；但還是可以發(fā)現(xiàn)隨著甲醇比例變小，間氨基苯磺酸的保留時(shí)間略有變長。而間硝基苯磺酸鈉保留時(shí)間適當(dāng)，保留較好，且隨著流動(dòng)相中磷酸二氫鉀溶液和甲醇比例變化，其保留時(shí)間變化比較明顯；隨著甲醇比例變小，間硝基苯磺酸鈉的保留時(shí)間明顯變長。隨著流動(dòng)相中磷酸二氫鉀溶液和甲醇比例變化，間氨基苯磺酸和間硝基苯磺酸鈉兩者都能有較好分離。

雜質(zhì)與間氨基苯磺酸的保留時(shí)間很接近，由表1可知，有機(jī)相比例不夠低時(shí)，雜質(zhì)與間氨基苯磺酸共同出峰，所以在間氨基苯磺酸和間硝基苯磺酸鈉分離和檢測(cè)中主要是要考察將雜質(zhì)和間氨基苯磺酸能夠分開的條件。

雖然間氨基苯磺酸和雜質(zhì)的保留時(shí)間都比較短，但是雜質(zhì)的保留時(shí)間比間氨基苯磺酸更短，且可以明顯發(fā)現(xiàn)，隨著甲醇比例的減小，雜質(zhì)和間氨基苯磺酸有逐漸分離的趨勢(shì)。當(dāng)流動(dòng)相中20mmol/L磷酸二氫鉀溶液:甲醇=8∶2時(shí)雜質(zhì)和間氨基苯磺酸的分離度為1.332，未達(dá)到分離的要求，而當(dāng)流動(dòng)相中20mmol/L磷酸二氫鉀溶液:甲醇=9∶1時(shí)雜質(zhì)和間氨基苯磺酸的分離度為2.483，達(dá)到分離的要求，所以選擇此流動(dòng)相比例作為分離的流動(dòng)相。

表1 pH為3.5時(shí)不同流動(dòng)相比例下的保留時(shí)間和分離度Table 1 Retention time and resolution of pH for 3.5 by differentmobile phase

2.1.3 pH的選擇

在選定流動(dòng)相比例的情況下，研究在不同pH條件下雜質(zhì)、間氨基苯磺酸和間硝基苯磺酸鈉的保留時(shí)間以及間氨基苯磺酸和雜質(zhì)的分離度情況，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，間氨基苯磺酸和間硝基苯磺酸鈉保留時(shí)間隨流動(dòng)相pH值增大而增大，間氨基苯磺酸鈉與雜質(zhì)間的分離度隨pH值增大先增大再減小。當(dāng)pH=2.5時(shí)，雜質(zhì)與間氨基苯磺酸鈉分離度為1.18，當(dāng)pH=3.0～3.5時(shí)，雜質(zhì)與間氨基苯磺酸鈉的分離效果較好，分離度達(dá)2.48～2.53，即達(dá)基線分離。當(dāng)pH=4.0時(shí)，雖然分離度大于1.5，但是間硝基苯磺酸鈉拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重。因此選擇了流動(dòng)相pH=3.5。

表2 20mmol/L磷酸二氫鉀溶液:甲醇=9:1時(shí)不同pH下的保留時(shí)間和分離度Table 2 Retention time and resolution of 20m mol/L potassium dihydrogan phosphate solution: methanol=9∶1 for different pH

圖2 間硝基苯磺酸鈉和間氨基苯磺酸混合液的高效液相色譜圖Figure 2 High performance liquid chromatogram figure of the mixture of sodium 3-nitrobenzenesulfonic acid and 3-aminobenzenesulfonic acid

通過流動(dòng)相組成和流動(dòng)相pH值的選擇，確定同時(shí)分離測(cè)定間氨基苯磺酸鈉和間硝基苯磺酸鈉的色譜條件為：

色譜柱：WatersAtlantisC18柱（4.6mm×150mm，5.0μm）；流動(dòng)相：20mmol/L磷酸二氫鉀溶液:甲醇=9∶1（其中磷酸二氫鉀溶液的pH為3.5）；進(jìn)樣量：10μL；流速：1 mL/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長：220 nm。

在此色譜條件下，間氨基苯磺酸鈉試樣中間氨基苯磺酸和間硝基苯磺酸鈉以及雜質(zhì)間具有良好分離效果，見圖2。

2.2 線性范圍的測(cè)定

將不同濃度的間硝基苯磺酸鈉和間氨基苯磺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在上述選定的色譜測(cè)定條件下混合進(jìn)樣進(jìn)行分析測(cè)定，進(jìn)樣體積為10μL。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖3所示，在試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，間硝基苯磺酸鈉和間氨基苯磺酸與其峰面積均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其中間硝基苯磺酸鈉的線性回歸方程為A1=2.4653C1-0.0003（R2=0.9979），間氨基苯磺酸的線性回歸方程為A2=1.6411C2+0.0534（R2= 0.9995）。

圖3 間硝基苯磺酸鈉（a）和間氨基苯磺酸（b）標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 3 Standard curve of the sodium 3-nitrobenzenesulfonic acid（a）and 3-aminobenzenesulfonic acid（b）

2.3 方法的精密度測(cè)定

為了考察該方法的精密度還做了重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，對(duì)同一份試樣用相同方法配制9份樣品，分別進(jìn)樣，測(cè)得保留時(shí)間和峰面積結(jié)果如表3所示。

2.4 方法的回收率測(cè)定

在已知含量的樣品中加入80%、100%、120%的標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)樣三次測(cè)定回收率，結(jié)果如表4所示。測(cè)得間硝基苯磺酸鈉的回收率范圍為100.57%～102.62%，平均回收率為101.50%。間氨基苯磺酸的回收率范圍為98.03%～100.09%，平均回收率為98.86%。

2.5 樣品檢測(cè)

按照建立的液相方法，選取兩批反應(yīng)液進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定兩次，結(jié)果表5所示。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的保留時(shí)間和峰面積Table 3 Retention time and peak areaof repeated experiments

表4 間氨基苯磺酸和間硝基苯磺酸鈉的回收率Table 4 The recovery of sodium 3-nitrobenzenesulfonic acid and 3-am inobenzenesulfonic acid

3 結(jié)論

以上結(jié)果顯示，本文所建立的高效液相色譜法可以進(jìn)行間硝基苯磺酸鈉、間氨基苯磺酸和雜質(zhì)的檢測(cè)和分析，操作簡(jiǎn)單快速、靈敏準(zhǔn)確，樣品不需要任何預(yù)處理，適用于生產(chǎn)過程的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及質(zhì)量控制分析。

表5 反應(yīng)液樣品測(cè)定Table 5 Determ ination of reaction samples

[1]陳黎明，丁飛．高效液相色譜法檢測(cè)間氨基苯酚和間氨基苯磺酸[J]．福建分析測(cè)試，2008，17（4）:25-26．

[2]李良，梁秋霞，劉維，等.間氨基苯磺酸的合成方法與工業(yè)生產(chǎn)過程[J].精細(xì)化工中間體，2010，40（3）:8-11.

[3]孟明揚(yáng).王玉燦.楊文東，等.催化加氫法合成芳磺酸氨基化合物[J].染料與染色，2010（4）:43-45

[4]張慧榮，周圍，王波，等.環(huán)境水體中4種氨基苯磺酸類物質(zhì)的HPLC法測(cè)定[J].分析試驗(yàn)室，2013，32（3）：121-124.

[5]陳繼新，王芳．間硝基苯磺酸鈉的制備工藝研究[J]．吉林化工學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，21（2）：9-11．

[6]Ravichandran C，Noel M，Thangavelu S，et al.The pH-dependent adsorption ofm-nitrobenzene sulphonic acid on a thermally prepared Ti/TiO2electrode[J].Journal of Electroanalytical Chemistry，1994，369（s1～2）:217-221.

[7]嚴(yán)新煥，許丹倩，懷哲明，等.液相催化加氫法合成間氨基苯磺酸[J].染料與染色，2001，38（2）：40-41.

[8]羅潤富.一種催化加氫制備氨基苯磺酸的方法:CN，101362710B[P].2013-03-20.

[9]羅俊龍．一種催化加氧制備氨基苯磺酸的方法：CN，200810223416.4『P]．2009-02-11．

[10]白雪松，李付剛.高效液相色譜法分析間氨基苯磺酸[J].染料與染色，2012,49（5）:54-55.

HPLC M ethod for the Determ ination of 3-Am inobenzenesulfonic Acid and Sodium 3-nitrobenzenesulfonate

YAO Li-li1，SHIJie-hua1,2
(1.College of Phamaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou，Zhejiang 310014，China;2.State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry-Synthesis Technology，Zhejiang University of Technology，Hangzhou，Zhejiang 310014，China）

A high performance liquid chromatographic method was used to determine the 3-aminobenzenesulfonic Acid and Sodium 3-nitrobenzenesulfonate.The influencing factors such as the proportion ofmobile phase and pH ofmobile phasewere investigated，and themethods of the selected chromatographic conditionswere verified.Results show that using the waters Atlantis C18 column（4.6mm×150mm，5.0μm），with themobile phase of potassium dihydrogan phosphate solution:methanol=9∶1，which concentration of potassium dihydrogan phosphate solution for 20 mmol/L and the pH of 3.5，the detection wavelength was 220 nm.The flow rate was 1mL/min.The column temperature is 25℃.Themethod can achieve the separation effect and themethod of of precision，linearity and recovery rate are all up to the requirements.The method is accurate，sensitive and reproducible.

HPLC；3-aminobenzenesulfonic acid；sodium 3-nitrobenzenesulfonate

1006-4184（2017）1-0050-05

2016-06-28

姚麗利（1990-），女，研究方向：藥物分析。E-mail:443795683@qq.com。