韓 靜 張繼州 鐘志鳳 胡 娟,2*

1.福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122

實(shí)驗(yàn)研究

栝樓桂枝湯對(duì)腦缺血再灌注大鼠肢體功能及GAP-43的影響

韓 靜1張繼州1鐘志鳳1胡 娟1,2*

1.福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122

目的：探討栝樓桂枝湯對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后肢體運(yùn)動(dòng)功能以及生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43的作用。方法：SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和栝樓桂枝湯組各7只，線栓法制作大鼠腦缺血再灌注模型，栝樓桂枝湯組于造模后給予栝樓桂枝湯治療，每日1次，連續(xù)14d。分別于造模后1d、3d、7d和14d采用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分(mNSS)、平衡木平衡試驗(yàn)(BeamBalance)、足失誤試驗(yàn)評(píng)價(jià)神經(jīng)功能恢復(fù)狀況；采用免疫熒光組織化學(xué)方法檢測(cè)腦缺血周邊區(qū)GAP-43的表達(dá)。結(jié)果：栝樓桂枝湯可顯著降低腦缺血損傷大鼠的mNSS評(píng)分、降低BeamBalance評(píng)分，減小足失誤比率(P<0.05)。栝樓桂枝湯組GAP43陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組顯著升高(P<0.05)。結(jié)論：栝樓桂枝湯可促進(jìn)腦缺血損傷大鼠肢體功能的恢復(fù)，該活性可能與其增加腦組織GAP-43蛋白的表達(dá)相關(guān)。

栝樓桂枝湯；腦缺血；肢體功能；GAP-43

缺血性腦卒中以高發(fā)病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率己成為嚴(yán)重威脅人類生命與健康的主要疾病之一，超過(guò)三分之二的缺血性腦卒中患者遺留有不同程度的后遺癥，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[1]。目前，針對(duì)缺血性腦卒中后遺癥尚無(wú)有效治療藥物，因此，研發(fā)可改善因腦缺血損傷所致的肢體障礙的藥物具有重要的臨床意義與應(yīng)用前景。

栝樓桂枝湯出自張仲景《金匱要略》，用于治療太陽(yáng)病引起的痙攣及內(nèi)傷雜病中出現(xiàn)的抽搐、發(fā)痙、手足蠕動(dòng)等，福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)院在臨床實(shí)踐中將該方運(yùn)用于治療腦卒中后肢體痙攣，重用栝樓根，取其清熱生津、柔潤(rùn)筋脈之效，取得了顯著的療效[2-3]。本研究在大鼠腦缺血再灌注模型上觀察栝樓桂枝湯對(duì)大鼠肢體功能障礙的作用，并通過(guò)觀察該方對(duì)腦組織生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43(Growth Associated Protein-43，GAP-43)表達(dá)的作用探討栝樓桂枝湯治療腦缺血的作用機(jī)制。

1 動(dòng)物與材料

1.1 動(dòng)物 SD大鼠，雄性，280～300g，共21只，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司(許可證號(hào)SCXK(滬)2015-0002)，光暗周期12/12 h(光照時(shí)間8:00～20:00)下飼養(yǎng)，自由飲食。

1.2 材料 中藥飲片天花粉(批號(hào)：16031)、桂枝(批號(hào)：160402)、芍藥、甘草(批號(hào)：160401)、大棗(批號(hào)：160401)購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬國(guó)醫(yī)堂。兔抗GAP-43抗體(批號(hào)：ab16053，Abcam公司)，免疫熒光封閉液、抗熒光淬滅封片劑等購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 大鼠局灶性腦缺血再灌注模型 采用線栓法制作大腦中動(dòng)脈閉塞/再灌注模型[4]。10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉動(dòng)物，鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(Common Carotidartery, CCA)、頸外動(dòng)脈(External Carotidartery, ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(Internal Carotid Artery, ICA)，分別電凝ECA分支枕動(dòng)脈和甲狀腺上動(dòng)脈。在距CCA分叉大約1cm處結(jié)扎ECA近心端，電凝遠(yuǎn)心端。夾閉CCA，在ECA殘端距CCA分叉3mm處剪一小口，將MCAO線栓經(jīng)ECA插入ICA，線栓頭端距CCA分叉處約18mm，此時(shí)進(jìn)線有輕微阻力，栓線正好插至顱內(nèi)的大腦前動(dòng)脈，堵住大腦中動(dòng)脈(MCA)開(kāi)口，制成MCAO模型。造模后2h，以半劑量10%水合氯醛再次麻醉動(dòng)物，拔出線栓，結(jié)扎ECA殘端。術(shù)后20～25℃條件下飼養(yǎng)大鼠，自由進(jìn)食水。假手術(shù)組除不在頸內(nèi)動(dòng)脈插入線栓外，其余步驟與上述相同。

模型制作后按Longa神經(jīng)功能缺失5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，評(píng)1～3分者為模型成功納入標(biāo)準(zhǔn)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：無(wú)明顯神經(jīng)缺損癥狀，活動(dòng)正常；1分：提尾懸空時(shí)不能完全伸展左側(cè)前爪；2分：行走時(shí)身體向偏癱的左側(cè)轉(zhuǎn)圈，即追尾征；3分：行走時(shí)向偏癱的左側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走或清醒障礙。

2.2 中藥煎煮方法及動(dòng)物分組給藥 栝樓桂枝湯煎劑由天花粉30g，桂枝9g，芍藥15g，甘草6g，生姜9g，大棗12 枚組成。按藥典方法進(jìn)行顯微鑒定和指標(biāo)性成分含量測(cè)定，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)方可使用。中藥飲片放入電藥鍋加入去離子水，以水面超過(guò)藥物3～5cm為宜，浸泡40min后煎煮；先用武火燒開(kāi)，再用文火煎熬20min；煎煮2次，合并2次煎液濃縮。根據(jù)動(dòng)物體表面積等效劑量表計(jì)算，大鼠的灌胃劑量為生藥量5g/kg體重。

SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和栝樓桂枝湯組，每組7只，按上述方法造模，栝樓桂枝湯組于再灌注后即刻灌胃給予栝樓桂枝湯，每日1次，連續(xù)給藥14d，模型組和假手術(shù)組灌胃給予等體積生理鹽水。

2.3 動(dòng)物神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)于大鼠腦缺血再灌注后第1天、3天、7天、14天4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，采用mNSS評(píng)分、平衡木平衡試驗(yàn)和足失誤試驗(yàn)，對(duì)動(dòng)物神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)進(jìn)行評(píng)分。

2.3.1 mNSS評(píng)分 參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行改良神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度評(píng)分法(Modified Neurological Severity Score，mNSS)，mNSS評(píng)分包含了對(duì)運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、反射及平衡的全面評(píng)價(jià)，最低分0分,最高分14分。0分為神經(jīng)功能正常；1～5分為神經(jīng)功能輕度損害；6～9分為神經(jīng)功能中度損害；10～14分為神經(jīng)功能重度損害。

2.3.2 平衡木平衡試驗(yàn) 平衡木平衡試驗(yàn)評(píng)價(jià)動(dòng)物肢體的協(xié)調(diào)和平衡能力，動(dòng)物放置在1根寬1.5cm，長(zhǎng)30cm，高于地面30cm的木條[6]上，觀察動(dòng)物在其上的行為表現(xiàn)，評(píng)分為0～6分。0分：保持平衡穩(wěn)定狀態(tài)；1分：抓緊平衡木邊緣；2分：抓緊平衡木并1只腳從平衡木落下；3分：抓緊平衡木，并且2只腳從平衡木上落下，或在平衡木旋轉(zhuǎn)(>60s)；4分：試圖在平衡木上保持平衡，但落下(>40s)；5分：試圖在平衡木上保持平衡，但落下(>20s)；6分：落下：沒(méi)有試圖保持平衡或抓住平衡木(<20s)。得分越高神經(jīng)損傷越嚴(yán)重。

2.3.3 足失誤試驗(yàn) 足失誤試驗(yàn)[7]是評(píng)價(jià)動(dòng)物前肢定位功能的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被放置在1個(gè)45 cm×30 cm，高于地面2.5cm的網(wǎng)格平板上，網(wǎng)格的尺寸是2.5 cm×2.5 cm，生理情況下，動(dòng)物在網(wǎng)格上行進(jìn)時(shí)會(huì)將它們的爪子放在網(wǎng)格線的交叉處，當(dāng)病理?xiàng)l件下，動(dòng)物無(wú)法正確放置它們的爪子，前肢會(huì)掉落在網(wǎng)格中。當(dāng)爪子掉落或滑落在網(wǎng)格線之間，被記錄為1次足失誤，記錄3min內(nèi)，雙側(cè)前肢行走步數(shù)及其中左側(cè)前肢的足失誤次數(shù)，以足失誤次數(shù)占總的前肢行走步數(shù)的百分比表示足失誤評(píng)分。

2.4 免疫熒光化學(xué)染色及圖像分析 最后一次行為學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)束后，各組取5只動(dòng)物，10%水合氯醛麻醉，經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛，取腦，經(jīng)20%、30%蔗糖梯度脫水后，制作30μm冠狀冰凍切片。采用漂片法進(jìn)行GAP-43免疫熒光染色，切片經(jīng)0.01MPBS洗滌后，在山羊血清中室溫封閉1h，然后抗GAP-43抗體(1：400)中4℃孵育過(guò)夜，隨后在熒光標(biāo)記二抗中37℃避光孵育1h。最后將切片裱于玻片，用抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡400倍鏡下觀察并拍照，各組每例動(dòng)物均拍攝2張腦片，每張切片拍攝5個(gè)不重疊的隨機(jī)視野，計(jì)數(shù)各視野的平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 栝樓桂枝湯改善腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 大鼠腦缺血再灌注后，神經(jīng)功能減弱，mNSS評(píng)分顯著增加(P<0.01)，給予栝樓桂枝湯，于腦缺血再灌注后1d起即可顯著降低mNSS評(píng)分(P<0.05)，改善神經(jīng)行為學(xué)功能(見(jiàn)表1)。平衡木測(cè)試和足失誤測(cè)試是評(píng)價(jià)動(dòng)物平衡和肢體協(xié)調(diào)能力的測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表2、3，栝樓桂枝湯組動(dòng)物在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的BeamBalance評(píng)分均低于模型組(P<0.05)，腦缺血再灌注后1d、3d和7d，栝樓桂枝湯組動(dòng)物足失誤的比率低于模型組(P<0.05)，表明栝樓桂枝湯可改善腦缺血?jiǎng)游镏w平衡力和肢體的協(xié)調(diào)性。

表1 栝樓桂枝湯對(duì)mNSS評(píng)分的影響 (分

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與假手術(shù)組比較，#P<0.01。

表2 栝樓桂枝湯對(duì)Beam Balance評(píng)分的影響 (分

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與假手術(shù)組比較，#P<0.01。

表3 栝樓桂枝湯對(duì)足失誤評(píng)分的影響 (分

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與假手術(shù)組比較，#P<0.01。

3.2 栝樓桂枝湯對(duì)腦缺血周邊腦皮質(zhì)GAP-43表達(dá)的影響 免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，GAP-43陽(yáng)性標(biāo)記主要分布于神經(jīng)細(xì)胞胞體和突起的胞質(zhì)中，假手術(shù)組僅有少量GAP-43陽(yáng)性染色分布。模型組GAP-43陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著多于假手術(shù)組(P<0.01)，而給予栝樓桂枝湯治療可增加GAP-43的免疫熒光強(qiáng)度，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)。

組別例數(shù)GAP-43陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)假手術(shù)組520.86±3.88模型組5 41.34±11.06#栝樓桂枝湯組5 56.6±7.79*

注：與模型組比較，*P<0.05；與假手術(shù)組比較，#P<0.01。

4 討論

研究采用mNSS、平衡木平衡、足失誤試驗(yàn)等多種神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)手段，觀察了栝樓桂枝湯對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)行為和肢體障礙康復(fù)的作用，結(jié)果顯示栝樓桂枝湯可顯著改善腦缺血所致的神經(jīng)行為功能障礙，改善動(dòng)物平衡力和肢體協(xié)調(diào)性，表明了栝樓桂枝湯對(duì)腦缺血損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用。

GAP-43是神經(jīng)組織特異性磷酸蛋白，分布于神經(jīng)元、再生的雪旺細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程的軸突生長(zhǎng)和突觸形成具有重要的促進(jìn)作用，被認(rèn)為是神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)發(fā)育和可塑性的分子標(biāo)記物[8]。研究顯示[9]，在腦缺血損傷時(shí)，GAP-43的表達(dá)增高與內(nèi)源性神經(jīng)再生相關(guān)。本研究顯示，大鼠腦缺血再灌注損傷14d后，腦組織缺血周邊皮質(zhì)GAP-43的表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，給予栝樓桂枝湯后觀察到，大鼠腦缺血周邊區(qū)腦皮質(zhì)GAP-43的表達(dá)顯著升高，這一結(jié)果表明栝樓桂枝湯可促進(jìn)腦缺血損傷后的軸突生長(zhǎng)發(fā)育和突觸可塑性，這可能是栝樓桂枝湯改善腦缺血后肢體功能障礙的機(jī)制之一。

[1]Digicaylioglu M.Erythropoietin in stroke: quo vadis[J].Expert Opin Biol Ther，2010, 10(6): 937-949.

[2]陳瑛玲,陳立典,陶靜.栝樓桂枝湯治療中風(fēng)后肢體痙攣的臨床研究 [J].中醫(yī)臨床研究, 2013, 5 (4): 7-9.

[3]楊春梅,陳立典,陶靜.古方今用瓜蔞桂枝湯 [J].遼寧中醫(yī)雜志, 2012, 39 (8): 1599-1601.

[4]Han J,Xiao Q, Lin YH, et al.Neuroprotective effects of salidroside on focal cerebral ischemia/reperfusion injury involve the nuclear erythroid 2-related factor 2 pathway [J].Neural Regen Res, 2015, 10(12): 1989-1996.

[5]Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al.Reversiblemiddle cerebral artery occlusionwithout craniectomy in rats [J].Stroke, 1989, 20:84-91.

[6]Shohami E, Novikov M, Bass R.Long-term effect of HU-211, a novel non-competitive NMDA antagonist, on motor and memory functions after closed head injury in the rat [J].Brain Res, 1995, 674(1): 55-62.

[7]Chao OY, Pum ME, Li JS, et al.The grid-walking test: assessment of sensorimotor deficits after moderate or severe dopamine depletion by 6-hydroxydopamine lesions in the dorsal striatum and medial forebrain bundle [J].Neuroscience, 2012, 202: 318-325.

[8]劉廣義.大鼠腦缺血再灌注損傷后GAP-43及IGF-1在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá) [J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志, 2008, 7 (3): 223-226.

[9]石旺清, 鄭關(guān)毅, 陳曉東, 等.大鼠腦缺血/再灌注后 bFGF 和 GAP-43 的表達(dá)與神經(jīng)再生[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2013, 29 (1): 63-67.

(編輯：梁志慶)

2016-11-09

福建省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)(2014R1035-14)。

韓靜(1980-)，女，博士，副研究員，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)。E-mail：smilinghj@163.com

胡娟(196-)，女，漢族，碩士，教授，研究方向?yàn)橹兴幬镔|(zhì)基礎(chǔ)。E-mail：huj@fjtcm.edu.cn

R285

A

1007-8517(2017)02-0044-03