張宇，張玥，馬寧，王志成

（黑龍江省能源環(huán)境研究院，黑龍江哈爾濱150090）

HNHHJ-1脫硫菌株對DBT的脫硫條件優(yōu)化*

張宇，張玥，馬寧，王志成

（黑龍江省能源環(huán)境研究院，黑龍江哈爾濱150090）

將一株從大慶油田含油土壤中分離篩選得到的專一性脫硫力最高的菌株HNHHJ-1作為培養(yǎng)菌株，通過對DBT轉(zhuǎn)化為2-HBP的脫硫效率來了解初始pH值、氮源、碳源、培養(yǎng)溫度和搖瓶轉(zhuǎn)速條件對脫硫力的影響，并優(yōu)化培養(yǎng)條件。確定的最佳培養(yǎng)條件為：在30℃溫度下培養(yǎng)，每250mL三角瓶裝100mL培養(yǎng)基，接種量為1%（V/V），轉(zhuǎn)速為180r·min-1。在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，2-HBP生成量為22.806mg·L-1。

2-HBP；脫硫菌；條件優(yōu)化

石油是當(dāng)今世界的重要能源，同時(shí)也是化學(xué)工業(yè)的主要原料，因此，在每個(gè)國家的國民經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)中都具有舉足輕重的地位。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展對石油資源的需求量不斷加大，同時(shí)石油資源的大量消耗所產(chǎn)生的環(huán)境污染問題，也成為影響人類生存的重大問題。

石油資源中含有的大量無機(jī)硫和有機(jī)硫是人類生存環(huán)境的重要污染源，其在燃燒時(shí)產(chǎn)生的含硫氧化物排入大氣，是形成酸雨的主要原因，對環(huán)境和生態(tài)平衡造成嚴(yán)重的破壞。據(jù)報(bào)道，我國每年約有25000kt的SO2排入大氣，其中大部分來自石油產(chǎn)品的燃燒和精煉過程。另外，石油中的硫還會腐蝕輸送管線和貯存設(shè)備，使石油精煉的催化劑中毒，因此，石油中的硫化物也是煉油工業(yè)的大敵。

石油的總含硫量在0.03%～7.89%之間，除含單質(zhì)硫、硫化物之外，還有硫醇、噻吩、苯并噻吩、二苯并噻吩類及更為復(fù)雜的含硫機(jī)化合物約200種，多年的持續(xù)開發(fā)使得現(xiàn)存含硫量低的化石燃料越來越少，現(xiàn)在每天大約生產(chǎn)6000×104桶原油，硫的平均含量大約為1.1%，未來10年硫的平均含量還將繼續(xù)增加，達(dá)到1.3%以上。隨著能源危機(jī)的逐步加劇，高硫石油燃料的開發(fā)成為必然，而高硫化石燃料必須預(yù)先經(jīng)過脫硫處理才能進(jìn)一步使用［1-3］。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 菌種

專一性脫硫菌株HNHHJ-1，來自黑龍江省能源環(huán)境研究院環(huán)境科學(xué)研究室（分離篩選自大慶油田含油土壤）。

1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基由質(zhì)量濃度為8.0g·L-1葡萄糖，2.5g·L-1NH4Cl，6.5g·L-1KH2PO4，8.5g·L-1K2HPO4，0.3g· L-1MgCl2·6H2O，分別加入1.0mL·L-1微量元素溶液母液和維生素溶液母液，pH值7.0～7.2。微量元素母液由質(zhì)量濃度為0.8g·L-1FeCl2·4H2O，0.8g·L-1Zn-Cl2，0.8g·L-1MnCl2·4H2O，0.2g·L-1NaMoO4·2H2O，0.08g·L-1CuCl2，0.08g·L-1NaWO4·2H2O和150mmol· L-1HCl。維生素母液由質(zhì)量濃度500mg·L-1泛酸鈣，300mg·L-1肌醇，500mg·L-1煙酸，500mg·L-1鹽酸吡哆醇，300mg·L-1對氨基甲苯和0.8mg·L-1維生素B12。

選擇性培養(yǎng)基：將一定濃度的DBT加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。

1.3 主要藥品、試劑和設(shè)備

甲醇（HPLC），二苯并噻吩（DBT），蛋白胨，尿素，酵母提取物，葡萄糖，麥芽糖，可溶性淀粉，NH4Cl，NH4NO2，NH4NO3，KH2PO4，K2HPO4，MgCl2·6H2O，F(xiàn)eCl2·4H2O，ZnCl2，MnCl2·4H2O，NaMoO4·2H2O，Cu-Cl2,NaWO4·2HO,HCl，泛酸鈣，肌醇，煙酸，鹽酸吡哆醇，對氨基甲苯和維生素

超高效液相色譜儀（包括Waters 510泵，柱溫箱，Waters PDA檢測器和Waters EmpowerTM美國Waters公司）；色譜柱（ACQVITY DPLC@BEH C18，50× 2.1mm，1.7μm美國Waters公司）；超聲波清洗機(jī)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 脫硫菌HNHHJ-1單因素脫硫條件優(yōu)化在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中接種脫硫菌HNHHJ-1，在30℃條件下培養(yǎng)至OD600光度值1.2時(shí)，按10%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接到新的選擇性培養(yǎng)基中。

（1）對脫硫效果的影響因素一——不同初始pH值條件下為確定在不同pH條件下培養(yǎng)對脫硫效果的影響，保持在基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，溫度、轉(zhuǎn)速等其他條件不變的情況下，用0.1mol·L-1NaOH或0.1mol·L-1HCl溶液調(diào)節(jié)選擇性培養(yǎng)基的pH值，分別使培養(yǎng)基的初始pH=5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。

（2）對脫硫效果的影響因素二——不同氮源條件下為確定不同氮源條件下培養(yǎng)對脫硫效果的影響，保持基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，溫度、轉(zhuǎn)速等其他條件不變的情況下，改變唯一氮源的種類，使用的氮源分別為質(zhì)量濃度為0.2%尿素、酵母提取物、蛋白胨、NaNO2、NH4Cl、NH4NO2。

（3）對脫硫效果的影響因素三——不同碳源條件下為確定不同碳源條件下培養(yǎng)對脫硫效果的影響，保持基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，溫度、轉(zhuǎn)速等其他條件不變的情況下，改變唯一碳源的種類，使用的碳源分別為質(zhì)量濃度為10g·L-1葡萄糖或麥芽糖及3g·L-1可溶性淀粉（4g·L-1已經(jīng)無法完全溶解）。

（4）對脫硫效果的影響因素四——不同培養(yǎng)溫度條件下為確定不同溫度條件下培養(yǎng)對脫硫效果的影響，保持基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，溫度、轉(zhuǎn)速等其他條件不變的情況下，分別選取不同培養(yǎng)溫度2、25、28、30、32、35、40℃。

（5）對脫硫效果的影響因素五——不同轉(zhuǎn)速條件下為確定不同轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)對脫硫效果的影響，保持基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，溫度、轉(zhuǎn)速等其他條件不變，分別選用轉(zhuǎn)速為80、100、120、150、180、200 r·min-1。

1.4.2 HPLC法測定2-HBP含量將利用脫硫菌HNHHJ-1培養(yǎng)后的菌液分別轉(zhuǎn)接種于優(yōu)化前和優(yōu)化后的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)3d，取100mL培養(yǎng)液，于8000r·min-1離心20mm，取上清液與等體積的正己烷萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除正己烷，蒸發(fā)瓶內(nèi)殘留物用甲醇定容至10mL用UPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同初始pH值的影響

圖1 初始pH值對脫硫菌脫硫力和生長情況的影響Fig.1 Influence of initial pH on desulfurization force and desulfurization bacterium growth

由圖1可見，其脫硫能力在初始pH值為7.0時(shí)，菌體濃度已經(jīng)達(dá)到最大值，但也可以看出2-HBP生成量并不高，含量約為12.426mg·L-1；在初始pH值為8.0時(shí)，菌體脫硫力達(dá)到最大，但菌體生長情況不好，2-HBP含量為23.027mg·L-1；原因可能是在堿性條件下，脫硫酶的活性更好，但菌體生長確不是很好，故初始pH值在7.5時(shí)，菌體生長和脫硫力兩者都不錯(cuò)，因此，選擇7.5為最佳pH值。

2.2 不同氮源的影響

在不同的氮源條件下培養(yǎng)不但對菌體生長有影響，同樣對菌株脫硫力也有影響。結(jié)果見圖2。

圖2 不同氮源對脫硫菌脫硫力和生長情況的影響Fig.2 Influence of nitrogen source on desulfurization force and desulfurization bacterium growth

由圖2可見菌體HNHHJ-1以有機(jī)氮源蛋白胨作為唯一氮源的培養(yǎng)基中，測得發(fā)酵液中2-HBP含量為20.925mg·L-1，菌體HNHHJ-1的脫硫力最高。即蛋白胨為最佳有機(jī)氮源。菌體HNHHJ-1以無機(jī)氮源NH4Cl為唯一氮源的培養(yǎng)基中，測得發(fā)酵液中2-HBP含量為21.873mg·L-1，脫硫力達(dá)到最大。即NH4Cl為最佳無機(jī)氮源。

2.3 不同碳源的影響

菌株在不同的碳源條件下培養(yǎng)對生長影響很大，同時(shí)也是決定菌株脫硫力的關(guān)鍵因素。

圖3 不同碳源對脫硫菌脫硫力和生長情況的影響Fig.2 Influence of carbon source on desulfurization force and desulfurization bacterium growth

結(jié)果由圖3可知，無論以葡萄糖、麥芽糖還是可溶性淀粉哪種為唯一碳源，菌體生長情況都差不多，表明這3種碳源對菌體生長影響不大。當(dāng)可溶性淀粉為唯一碳源時(shí)，脫硫力達(dá)到最大，測得2-HBP含量為22.892 mg·L-1。故選擇可溶性淀粉為最佳碳源。

2.4 培養(yǎng)溫度的影響

圖4 培養(yǎng)溫度對脫硫菌脫硫力和生長情況的影響Fig.4 Influence of incubation temperature on desulfurization force and desulfurization bacterium growth

由圖4可知，培養(yǎng)溫度對菌體生長情況和脫硫力影響，當(dāng)溫度由20℃上升到30℃時(shí)，隨著溫度的升高，菌體生長情況和脫硫力均下降；當(dāng)溫度高于30℃升高到40℃時(shí)，隨著溫度的上升，菌體生長情況和脫硫力均下降；只有在溫度為30℃時(shí)，測得2-HBP的生成量約為22.106mg·L-1，且生成量最大，同時(shí)菌體HNHHJ-1生長生物量也達(dá)到最大吸光值（OD660= 0.258），因?yàn)闇囟仁蔷w生長代謝和脫硫相關(guān)酶活性的重要影響因素，因此，最佳培養(yǎng)溫度為30℃。

2.5 搖瓶轉(zhuǎn)速的影響

圖5 搖瓶轉(zhuǎn)速對脫硫菌脫硫力和生長情況的影響Fig.5 Influence of shake calabash speed on desulfurization force and desulfurization bacterium growth

由圖5可知，搖瓶轉(zhuǎn)速對菌體生長情況和脫硫效率的影響，隨著搖瓶轉(zhuǎn)速的升高，菌體生長速率和脫硫效率隨著升高，當(dāng)搖瓶轉(zhuǎn)速升高至180r·min-1時(shí)，生長速率和脫硫效率都達(dá)到最大值，此時(shí)，2-HBP的生成量約等于22.698mg·L-1，；當(dāng)搖瓶轉(zhuǎn)速升高至180r·min-1后，再升高搖瓶轉(zhuǎn)速，菌體濃度已沒有沒有明顯變化，可以推測出，搖瓶轉(zhuǎn)速達(dá)到一定速度后與菌體生長情況已經(jīng)沒有了顯著的關(guān)系。因此，在研究范圍內(nèi)，以180r·min-1為最佳轉(zhuǎn)速。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)所用菌體為從大慶油田含油土壤中分離純化得到的一株具有專一性脫硫的微生物，并命名為HNHHJ-1，通過對該菌體進(jìn)行培養(yǎng)單因素脫硫條件優(yōu)化和超高效液相法定量檢測，得到最優(yōu)培養(yǎng)方案如下：可溶性淀粉的質(zhì)量濃度為3.0g·L-1，2.5g·L-1NH4Cl，6.5g·L-1KH2PO4，8.5g·L-1K2HPO4，0.3g·L-1MgCl2·6H2O，分別加入1.0mL·L-1微量元素溶液母液和維生素溶液母液，pH值7.0～7.2。在30℃溫度下培養(yǎng)，每250mL三角瓶裝100mL培養(yǎng)基，接種量為1%（V/V），轉(zhuǎn)速為180r·min-1。脫硫菌HNHHJ-1在最優(yōu)條件下培養(yǎng)，2-HBP生成量達(dá)到22.806mg·L-1，生成量是優(yōu)化前的1.5倍。

［1］吳瓊.高硫燃煤脫硫菌種的篩選及性能研究［D］.呼和浩特：內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)，2009.

［2］張英，李偉，王妙冬，等.專一性降解含硫雜環(huán)化合物菌株的分離和篩選［J］.高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào)，2005,19（3）：392-397.

［3］王莉麗.脫有機(jī)硫微生物的分離、鑒定及其選育［D］.哈爾濱：黑龍江大學(xué)，2008.

［4］馬挺，佟明友，張全，等.脫硫菌Fds-1的分離鑒定及其對柴油脫硫特性的研究［J］.微生物學(xué)報(bào)，2006,46（1）：104-110.

Optimal desulfurization conditions of desulfurization strain HNHHJ-1 on DBT desulfurization*

ZHANG Yu，ZHANG Yue，MA Ning，WANG Zhi-cheng
（Energy&Environmental Research Institute of Heilongjiang Province，Harbin 150090，China）

A high specificity desulfurization strain HNHHJ-1 which was isolated from the Daqing Oilfield oily soil had been studied.By comparing the efficiency of conversion dibenzothiophene（DBT）into 2-hydroxybiphenyl（2-HBP）,the influence of initial pH value,nitrogen source,carbon source,culture temperature and shake calabash speed on desulfurization conditions were investigated.The optimal culture conditions of HNHHJ-1 were finally determined.The results showed that the best culture conditions as follows:100 mL nutrient solution containing in every 250 mL conical flask,the inoculation of biomass was 1%,the speed was 180r·min-1,and the temperature was 30℃.In above optimum conditions,the yield of 2-HBP arrived at 22.806 mg·L-1.

2-HBP;desulfurization strain;conditions optimization

TE626.25

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20170111

2016-11-14

科研項(xiàng)目：黑龍江省青年科學(xué)基金項(xiàng)目（No.QC2014C028）

張宇（1983-），男，黑龍江肇州人，助理研究員，研究領(lǐng)域：環(huán)境與節(jié)能技術(shù)。

王志成（1973-），男，黑龍江哈爾濱人，研究員級高級工程師，從事生物質(zhì)能源、替代能源和室內(nèi)環(huán)境研究。