王鑫昕，耿霄，楊軍山，吳子龍

（1.邯鄲學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河北邯鄲056005；2.邯鄲叢臺(tái)酒業(yè)股份有限公司，河北邯鄲057550）

叢臺(tái)酒大曲春季培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)菌數(shù)量變化的研究

王鑫昕1，耿霄1，楊軍山2，吳子龍1

（1.邯鄲學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河北邯鄲056005；2.邯鄲叢臺(tái)酒業(yè)股份有限公司，河北邯鄲057550）

對(duì)中溫大曲春季培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)菌數(shù)量的變化情況進(jìn)行研究，以叢臺(tái)酒業(yè)春季生產(chǎn)的中溫大曲為研究對(duì)象，采用平板稀釋涂布法進(jìn)行細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，從大曲入房起，細(xì)菌數(shù)量隨著升高的曲溫迅速增加，曲皮中的細(xì)菌在培養(yǎng)第6天時(shí)達(dá)到高峰，含量為7.8×107個(gè)/g，之后又逐漸減少，到發(fā)酵第16天時(shí)降到105個(gè)/g，此后略有回升，維持在106個(gè)/g直至出房；曲心中細(xì)菌呈現(xiàn)同樣的增長(zhǎng)規(guī)律，只是含量高峰在第8天，為2.35×106個(gè)/g，16 d后維持在105個(gè)/g，曲心的高峰期和出房時(shí)的細(xì)菌數(shù)量均遠(yuǎn)低于曲皮。本研究將為后續(xù)大曲細(xì)菌培養(yǎng)的定向控制提供理論依據(jù)。

大曲；細(xì)菌；數(shù)量；曲皮；曲心

白酒釀造的微生物大多來(lái)自窖泥、糟醅和酒曲，但最主要的是來(lái)自酒曲。傳統(tǒng)的制曲過(guò)程是在曲料上自然富集多種微生物，這些微生物在曲料上競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)，最終適應(yīng)制曲環(huán)境得以生存并大量繁殖，在進(jìn)行生命活動(dòng)時(shí)產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物，賦予了白酒特有的風(fēng)味。因此，掌握酒曲中各種功能微生物的種類和代謝情況以及它們?cè)诎l(fā)酵過(guò)程中的變化規(guī)律，對(duì)提高白酒的品質(zhì)和產(chǎn)率具有重要的意義[1]。大曲中的細(xì)菌種類及數(shù)量影響著白酒的香型，細(xì)菌通過(guò)生香、代謝、熱能供應(yīng)、分解曲料中一些難以利用的物質(zhì)等作用改善白酒的風(fēng)味物質(zhì)[2]。大曲中細(xì)菌在整個(gè)制曲過(guò)程的種類和數(shù)量變化也與大曲品質(zhì)有緊密聯(lián)系[3]。目前，關(guān)于各種香型白酒大曲的制備過(guò)程中微生物種類和數(shù)量的變化規(guī)律，已有一些研究成果[4-8]。

本實(shí)驗(yàn)首次研究叢臺(tái)酒中溫大曲春季培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)菌數(shù)量的變化情況，可為后續(xù)研究大曲培養(yǎng)過(guò)程細(xì)菌的消長(zhǎng)規(guī)律、大曲細(xì)菌培養(yǎng)的定向控制提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù),為完善釀酒工藝、提高釀酒品質(zhì)與產(chǎn)率的目標(biāo)提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

曲樣：從4月開(kāi)始生產(chǎn)叢臺(tái)酒中溫大曲開(kāi)始，每隔1 d從同一曲房同批次大曲中采集一塊釀酒大曲，裝于無(wú)菌袋中，防止染菌，實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏0.3 g，蛋白胨1 g，氯化鈉0.5 g，瓊脂1.5～2.0 g，水100m L，放線菌酮100μg/m L，121℃滅菌20m in。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大曲樣品水分的測(cè)定

大曲水分測(cè)定采用烘干法，準(zhǔn)確稱取試樣5 g（精確至0.0002 g）于100～105℃烘干至恒重的扁平稱量瓶中，放入100～105℃烘箱中干燥3 h，趁熱蓋上蓋子，在干燥器中冷卻30m in，稱重，再于同樣條件下烘1 h，冷卻、稱重，直至恒重。

水分含量的計(jì)算方法為：水分含量＝（m1-m2）/(m1-m0)×100%。

式中：m0——稱量瓶質(zhì)量，g；m1——烘干前試樣與稱量瓶的總質(zhì)量，g；m2——烘干后試樣與稱量瓶的總質(zhì)量，g。

1.2.2 菌懸液的制備

在無(wú)菌環(huán)境中稱取曲皮、曲心各5 g（距大曲表面1 cm處為曲皮樣品，曲塊中心周圍都為曲心樣品），放于研缽中，分別加入10 m L無(wú)菌水，研磨至勻漿狀。10000 r/m in離心10m in，得到上清液，測(cè)出上清液的體積并記錄。

取6支無(wú)菌試管，依次標(biāo)記為10-1—10-6，在各試管中分別加入無(wú)菌水9m L，取上清菌液1m L于1號(hào)試管中，振蕩混勻，得到10-1稀釋度的菌懸液；從1號(hào)試管取1m L液體于2號(hào)試管中振蕩混勻，得到10-2稀釋度的菌懸液，依此類推可得到10-3、10-4、10-5……稀釋度的菌懸液。

1.2.3 涂布培養(yǎng)

準(zhǔn)備好牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板，分別標(biāo)記為10-2、10-3、10-4……以此類推。分別吸取各稀釋度的100μL菌懸液涂平板，每個(gè)稀釋度涂布3個(gè)平板。之后，將平板倒置，37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.4 細(xì)菌的菌落計(jì)數(shù)

選取適宜密度的培養(yǎng)皿（選取培養(yǎng)皿的細(xì)菌數(shù)量在30到300之間），根據(jù)細(xì)菌的菌落特征對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。

菌落總數(shù)的計(jì)算方法為：菌落總數(shù)=X0×V2/V1× n×m。

式中：X0——每板菌落數(shù)，個(gè)；V1——涂布體積，m L；m——樣品干重，g；V2——上清液體積，m L；n——最適稀釋度。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲中水分的變化（見(jiàn)圖1）

圖1 大曲培養(yǎng)過(guò)程中水分的變化

由圖1可知，整個(gè)大曲的含水量總體是呈下降趨勢(shì)的，曲皮的含水量總體比曲心低。在大曲成熟培養(yǎng)的過(guò)程中，其水分含量不斷降低，一是隨著微生物的大量繁殖，產(chǎn)生大量熱量，造成曲房溫度不斷升高，曲塊含水量因蒸發(fā)而降低，二是因?yàn)榇笄患奈⑸锷L(zhǎng)利用了其所含的水分。大部分曲塊成熟后期，曲塊含水量都會(huì)降到15%以下。曲皮水分總體呈下降趨勢(shì)，但在第14天時(shí)，含水量有略微的升高，之后又逐漸降低，這是因?yàn)樵诖似陂g，水分及熱量由里向外散發(fā)。

2.2 大曲培養(yǎng)過(guò)程中溫度的變化（見(jiàn)圖2）

圖2 大曲培養(yǎng)過(guò)程中溫度的變化

由圖2可知，曲溫總的變化趨勢(shì)是：大曲入曲房后，曲溫迅速上升，6～8 d時(shí)達(dá)到高峰，以后呈下降趨勢(shì)，14 d時(shí)達(dá)到最低，之后曲溫維持在30℃。

曲溫與室溫的變化，與曲塊中富集的微生物的繁殖與代謝密切相關(guān)。微生物的大量繁殖及其代謝，產(chǎn)生大量熱量，造成曲溫與室溫的升高。隨著微生物數(shù)量的減少，曲溫與室溫也逐漸降低。此外，曲溫與室溫改變的另一個(gè)決定性因素是人為的調(diào)控。人為調(diào)控通過(guò)窗戶的開(kāi)閉、草簾的鋪蓋或掀開(kāi)、改變各曲塊間的距離等實(shí)現(xiàn)。如在曲塊入房后的長(zhǎng)霉階段，溫度不可上升過(guò)快，否則影響上霉，此時(shí)可緩緩掀開(kāi)部分草簾進(jìn)行散熱。

2.3 大曲培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)菌數(shù)目的變化（見(jiàn)圖3）

圖3 大曲培養(yǎng)過(guò)程中曲皮細(xì)菌數(shù)量的變化

由圖3可知，大曲培養(yǎng)過(guò)程中，曲皮內(nèi)細(xì)菌數(shù)量的總變化趨勢(shì)是先迅速升高，后逐漸降低至最小值，之后又緩慢上升。在第6天，細(xì)菌數(shù)量達(dá)到高峰，最多可達(dá)7.8×107個(gè)/g，此后，細(xì)菌數(shù)量開(kāi)始下降，在第16天達(dá)到最小值，最少為7.6×105個(gè)/g，16 d后保持在106個(gè)/g的數(shù)量級(jí)。因而，4～12 d為曲皮細(xì)菌數(shù)量最多的時(shí)期。呈現(xiàn)這樣升高又降低的規(guī)律是因?yàn)?，培養(yǎng)初期升高的溫度加快菌體的生長(zhǎng)速率，也使曲溫繼續(xù)升高，生長(zhǎng)速率繼續(xù)增大，直到達(dá)到細(xì)菌生長(zhǎng)能夠承受的最高溫度，而此時(shí)水分的散失和曲皮營(yíng)養(yǎng)的消耗也使細(xì)菌數(shù)量積累達(dá)到限度，曲皮細(xì)菌數(shù)量便在第6天時(shí)達(dá)到了頂峰。此后，由于許多不耐熱的細(xì)菌因高溫致死，也就呈現(xiàn)了細(xì)菌數(shù)量在6 d后驟減的現(xiàn)象，隨著曲溫降低到細(xì)菌耐受溫度，環(huán)境中細(xì)菌再次富集在曲塊上，也就出現(xiàn)了曲皮細(xì)菌數(shù)略有回升的現(xiàn)象。

圖4 大曲培養(yǎng)過(guò)程中曲心細(xì)菌數(shù)量的變化

由圖4可知，大曲培養(yǎng)過(guò)程中，曲心內(nèi)細(xì)菌數(shù)量的總變化趨勢(shì)與曲皮的變化趨勢(shì)大致相同，也是先升高后降低，之后又緩慢上升。曲心內(nèi)細(xì)菌的數(shù)量在第8天達(dá)到頂峰，最高可達(dá)2.35×106個(gè)/g，此后，細(xì)菌數(shù)量開(kāi)始下降，在第16天降到最少，為3.0×105個(gè)/g。16 d后保持在105個(gè)/g的數(shù)量級(jí)。因而，6～13 d為曲皮細(xì)菌數(shù)目最多的時(shí)期。

比較曲皮、曲心細(xì)菌數(shù)量的變化曲線，曲皮中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)高于曲心中細(xì)菌的數(shù)量，而且曲心達(dá)到數(shù)量頂峰的時(shí)間滯后于曲皮，這是由于曲皮、曲心在通風(fēng)、水分、溫度和從環(huán)境富集細(xì)菌機(jī)會(huì)不同等方面的差異造成細(xì)菌類別、生長(zhǎng)繁殖速率的差異，進(jìn)而影響細(xì)菌數(shù)目間的差異。起初，曲皮中細(xì)菌數(shù)量先迅速增加，而曲心中細(xì)菌增長(zhǎng)較慢，這主要因?yàn)椋け┞对谇凯h(huán)境中，空氣中的細(xì)菌會(huì)自然富集在曲皮上，并利用營(yíng)養(yǎng)快速生長(zhǎng)；曲皮相對(duì)較好的通風(fēng)和營(yíng)養(yǎng)的配合使好氧菌生長(zhǎng)繁殖的更快；曲心的細(xì)菌是由曲皮向內(nèi)擴(kuò)散生長(zhǎng)，所以最初幾天曲心處細(xì)菌量較少，而且微生物產(chǎn)生的熱量不太高，導(dǎo)致曲心溫度升高緩慢，細(xì)菌生長(zhǎng)速率增加慢于曲皮。曲皮的細(xì)菌增長(zhǎng)迅速，曲溫快速升高，曲皮處營(yíng)養(yǎng)消耗快，曲皮細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)使曲皮細(xì)菌數(shù)量頂峰提前于曲心，于第6天結(jié)束了高增長(zhǎng)趨勢(shì)。此外，由于曲心處氧氣量少，好氧細(xì)菌無(wú)法正常存活，向曲心處生長(zhǎng)的以兼性和厭氧菌這些生長(zhǎng)繁殖慢的細(xì)菌為主，所以曲心增長(zhǎng)速率較曲皮慢很多，曲心的細(xì)菌量比曲皮的少許多。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，在大曲培養(yǎng)過(guò)程中，曲皮細(xì)菌數(shù)量的變化規(guī)律是，先迅速升高，在培養(yǎng)第6天達(dá)到最高峰，數(shù)量級(jí)達(dá)到107個(gè)/g。培養(yǎng)第16天時(shí)達(dá)到最小值，數(shù)量級(jí)達(dá)105個(gè)/g。曲心細(xì)菌數(shù)量的變化規(guī)律也是先升高，在培養(yǎng)第8天達(dá)到最大值，數(shù)量級(jí)為106個(gè)/g，在第16天數(shù)量最少，數(shù)量級(jí)為105個(gè)/g。細(xì)菌數(shù)量的變化是曲房?jī)?nèi)各個(gè)環(huán)境因素的綜合效果，制曲工藝緊密影響著細(xì)菌的種類和數(shù)量，進(jìn)而影響了白酒的質(zhì)量。曲皮與曲心的細(xì)菌數(shù)量變化是不同的，這也導(dǎo)致了曲皮與曲心的理化指標(biāo)和釀酒效果是明顯不同的。

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Change in the Quantity of Bacteria in Congtai Daqu during the Culture Process in Spring

WANG Xinxin1,GENG Xiao1,YANG Junshan2andWU Zilong1
(1.Department of Life Science and Engineering,Handan Colleage,Handan,Hebei056005; 2.Congtai Distillery Co.Ltd.,Handan,Hebei057550,China)

Medium-temperature Daqu produced in Congtai Distillery in Spring was used as the research object,the change in the quantity of bacteria during the culture process was investigated,and the quantity of bacteria was counted by dilution plating method.The results showed that,bacteria quantity increased rapidly along with the increase of the temperature since the beginning of the culture of Daqu in the room.Bacteria quantity on the surface of Daqu reached the maximum of 7.8×107cfu/g at the6th day of the culture and then dropped gradually and declined to 105cfu/g at the 16th day of the culture,and later bacteria quantity increased slightly to 106cfu/g and maintained at that level till the end of Daqu culture.Bacteria quantity in the core of Daqu presented the same rule except that bacteria quantity peak occurred on the8th day of the culture as2.35×106cfu/g and bacteria quantity maintained at the level of 105cfu/g after the16th day of the culture.Bacteria quantity peak and bacteria quantity at the end of the culture in the core of Daqu were far inferior to that on the surface of Daqu.This study provided theoretical evidence for subsequent directional control of bacteria in the culture of Daqu.

Daqu;bacteria;quantity;surface of Daqu;core of Daqu

TS262.3；TS261.1；Q93-3

A

1001-9286（2017）02-0037-03

10.13746/j.njkj.2016326

邯鄲市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(1523103064-5)。

2016-11-03

王鑫昕(1982-)，女，河北邯鄲人，講師，主要從事生化和發(fā)酵生產(chǎn)研究。