張聰芝，張龍云，李燕榮，蒲春

(江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800)

綿柔型白酒釀造用功能性細菌代謝典型風(fēng)味化合物研究

張聰芝，張龍云，李燕榮，蒲春

(江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800)

研究了綿柔型白酒釀造用功能性細菌風(fēng)味化合物的代謝情況。確立了不同菌株代謝不同風(fēng)味化合物優(yōu)勢性能；并通過優(yōu)化配方組合研究，建立了典型菌株混合發(fā)酵代謝典型風(fēng)味化合物的最佳配比組合；進一步對比分析不同比例及不同發(fā)酵形式下的代謝產(chǎn)物的含量，明確了優(yōu)化組合混合發(fā)酵在代謝四甲基吡嗪等典型化合物方面的優(yōu)勢。

綿柔型白酒；功能性細菌；風(fēng)味化合物；四甲基吡嗪

以洋河藍色經(jīng)典系列白酒為代表的綿柔型白酒逐漸受到消費者的青睞[1-2]，綿柔型白酒釀造用功能性細菌是綿柔型調(diào)味酒釀造的關(guān)鍵，是綿柔型白酒風(fēng)格形成的基礎(chǔ)。綿柔型白酒釀造用功能性細菌是經(jīng)過定向選育的釀酒有益功能微生物，通過運用現(xiàn)代生物工程技術(shù)及設(shè)備用于釀酒生產(chǎn)[3-4]。一方面功能性細菌為嗜熱芽孢桿菌，能夠代謝產(chǎn)生以四甲基吡嗪、愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚等為主的典型風(fēng)味化合物，四甲基吡嗪等典型化合物能夠為酒體提供焦香、烘烤香等堅果香氣[5]；同時，嗜熱芽孢桿菌代謝的酶系在高溫下能夠進一步推動美拉德反應(yīng)進程，促進了芝麻香香氣成分及前驅(qū)物質(zhì)的形成[6]。頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）是近幾年發(fā)展起來的測定大曲、酒醅、發(fā)酵液風(fēng)味物質(zhì)的方法，相比傳統(tǒng)風(fēng)味物質(zhì)的提取、測定，具有快速、高效、無溶劑揮發(fā)等特點[7]。本研究利用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用的方法，對本公司生產(chǎn)用12株功能性細菌風(fēng)味化合物形成情況進行了定性定量分析，確定了不同菌株代謝典型風(fēng)味化合物的優(yōu)勢；同時通過優(yōu)化組合確定了代謝以四甲基吡嗪為主的典型化合物的最佳組合；通過風(fēng)味化合物代謝的研究確定了功能性細菌代謝風(fēng)味化合物的優(yōu)勢，為促進制曲工藝的提升及進一步提高調(diào)味酒質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)，同時為綿柔型白酒生產(chǎn)及風(fēng)格的形成奠定了基礎(chǔ)[8-9]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

菌株：實驗菌株為枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌等，均為本公司篩選并保藏的菌株。

試劑：葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、無機鹽、氫氧化鈉、氯化鈉等；儀器：PHS-3E臺式pH計，LDZH-200KBS立式滅菌鍋，DNP-9162A電熱恒溫培養(yǎng)箱，島津氣質(zhì)聯(lián)用儀，HW-150C溫控振蕩培養(yǎng)箱，90-3恒溫雙向磁力攪拌器。

培養(yǎng)基：細菌平板及斜面培養(yǎng)基為牛肉膏、蛋白胨培養(yǎng)基；細菌種子培養(yǎng)基為葡萄糖、蛋白胨等培養(yǎng)基；細菌麩曲培養(yǎng)基為麩皮添加適量無機鹽培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基的滅菌條件為：121℃，滅菌20m in；發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌條件為溫度121℃，滅菌20m in。

1.2 實驗方法

培養(yǎng)方法：細菌液體三角瓶種子培養(yǎng)方法：裝液量300m L/500m L三角瓶，取1環(huán)新鮮細菌于培養(yǎng)基中，置于特定條件下?lián)u床培養(yǎng)。在1000m L三角瓶中進行固態(tài)麩曲培養(yǎng)；綿柔型生產(chǎn)用細菌曲采用現(xiàn)代化圓盤制曲設(shè)備進行控溫、通風(fēng)、攪拌發(fā)酵培養(yǎng)；定期取樣檢測[3]。

分析方法：pH值采用全自動pH計測定；微量風(fēng)味物質(zhì)采用頂空固相微萃取聯(lián)合氣質(zhì)聯(lián)用（HS-SPME-GCMS）進行定性定量分析[7]。

2 結(jié)果與討論

2.1 功能性細菌三角瓶固態(tài)發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)定性定量分析

2.1.1 功能性細菌固態(tài)發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)定性分析

通過純種液態(tài)培養(yǎng)功能性細菌種子液，然后接種到固態(tài)麩皮培養(yǎng)基中進行單菌種固態(tài)發(fā)酵，研究單個功能性細菌風(fēng)味物質(zhì)形成情況；運用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用的方法進行定性分析。

圖1 代表菌株146#吡嗪類化合物氣相色譜圖

經(jīng)過分析可知，功能性細菌定性到的化合物數(shù)量和種類都較多，既有相同又有獨特的風(fēng)味化合物：12株功能性細菌分別定性到30種、20種、30種、24種、27種、28種、28種、17種、27種、29種、38種、31種含量較多的風(fēng)味化合物，風(fēng)味化合物數(shù)量最多的是151#菌；功能性細菌代謝風(fēng)味化合物主要集中在醛類、酮類、吡嗪類化合物、多元醇、烯醇類、芳香族化合物、呋喃類化合物及其他雜環(huán)化合物等，還有少量的酸類、酯類、噻唑、噻吩、吡啶、吡咯化合物；其中定性到較多的吡嗪類化合物，主要有三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,4-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基-6-乙基吡嗪、2-乙基-3，5-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪（圖1）等，其中四甲基吡嗪可以賦予酒體焙烤香氣和焦香味；并且定性到吡嗪類化合物的前體2,3-丁二醇、3-羥基-2-丁酮（醋酉翁）等化合物，2,3-丁二醇在3#和152#菌株中定性到；3-羥基-2-丁酮（醋酉翁）在1#、3#、35#、102#、109#、139#、150#和152#8株菌中定性到，2,3-丁二醇和其他多元醇在酒中起助香作用，能增加綿、甜、柔軟、細膩感[8]，3-羥基-2-丁酮（醋酉翁）可以增加酒的悠長后味，嗜熱芽孢桿菌可以代謝這些物質(zhì)形成吡嗪類化合物；芳香族化合物中苯酚、β-苯乙醇、愈創(chuàng)木酚（2-甲氧基苯酚）、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚等含量較高。

2.1.2 功能性細菌固態(tài)發(fā)酵典型風(fēng)味物質(zhì)定量分析

通過運用內(nèi)標法計算，進一步對幾種典型風(fēng)味化合物含量進行定量分析，結(jié)果見表1、圖2。

表1 功能性細菌典型風(fēng)味化合物含量

圖2 代表菌株139#菌風(fēng)味化合物氣相色譜圖

由表1可知，吡嗪類化合物中四甲基吡嗪和三甲基吡嗪在各菌株中產(chǎn)量相對豐富，四甲基吡嗪產(chǎn)量最高的是139#菌，為23.45×10-10g/g，其次是3#菌，為20.54×10-10g/g，146#菌為20.13×10-10g/g，109#菌為19.99×10-10g/g；β-苯乙醇在12株菌中均定性定量檢測到，其中151#菌產(chǎn)量最高，為1.26×10-10g/g，3#菌為0.66×10-10g/g，35#菌為0.54× 10-10g/g；愈創(chuàng)木酚產(chǎn)量最高的是146#菌，為11.04×10-10g/g，其次是109#菌，為2.96×10-10g/g；4-乙烯基愈創(chuàng)木酚產(chǎn)量最高的是146#菌，為44.86×10-10g/g，其次是139#菌，為35.28×10-10g/g。β-苯乙醇具有濃郁的水果和蜂蜜的香氣，能夠賦予酒體自然發(fā)酵的香氣，愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚則可以提供較多的堅果類香氣，賦予酒體成熟的焦香、醬香，可以賦予調(diào)味酒較多的復(fù)合感、幽雅感。

2.2 功能性細菌三角瓶固態(tài)發(fā)酵典型風(fēng)味物質(zhì)配方組合研究

通過以上定性定量的綜合分析，鑒于139#、146#高產(chǎn)四甲基吡嗪及3#高產(chǎn)三甲基吡嗪的性能，151#高產(chǎn)β-苯乙醇性能，基于通過增加139#、3#、146#菌株比例提高四甲基吡嗪含量，增加146#、139#菌比例，提高4-乙烯基愈創(chuàng)木酚含量，增加151#比例，提高β-苯乙醇含量，增加152#比例，提高2,3-丁二醇含量，結(jié)合前期1#、109#、151#等發(fā)酵性能的優(yōu)勢，選取1#、3#、109#、139#、146#、151#進行優(yōu)化配方組合研究。

2.2.1 功能性細菌三角瓶固態(tài)發(fā)酵典型風(fēng)味物質(zhì)配方組合設(shè)計

首先純種培養(yǎng)各株菌種子液，按照配方優(yōu)化組合（表2）方案，按比例接種到三角瓶固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵，探尋功能微生物代謝以四甲基吡嗪為主，三甲基吡嗪、愈創(chuàng)木酚等典型風(fēng)味物質(zhì)的最佳組合，分別對混合發(fā)酵結(jié)束的功能性細菌麩曲的四甲基吡嗪、三甲基吡嗪含量等典型風(fēng)味化合物指標進行測定，結(jié)果見表3。

表2 配方組合研究設(shè)計

由表3可知，三甲基吡嗪產(chǎn)量最高的組合是組合5，為1.67×10-10g/g，四甲基吡嗪產(chǎn)量最高的組合是組合8，為3.49×10-10g/g，愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚產(chǎn)量最高的組合是組合2，為4.51×10-10g/g；其中組合8（1#∶3#∶109#∶139#∶146#∶151#=6∶36∶1∶11∶21∶26）在代謝四甲基吡嗪方面最為有利，四甲基吡嗪可以賦予酒體焙烤香氣和焦香，選取優(yōu)化組合8并進行比例化整（即比例A，1#∶3#∶139#∶146#∶151#=10∶35∶25∶20∶10），確定選取1#、3#、139#、146#、151#共5株菌進一步進行典型風(fēng)味化合物混合發(fā)酵研究。

表3 功能性細菌10種組合典型風(fēng)味化合物含量

2.2.2 功能性細菌三角瓶配方組合發(fā)酵典型風(fēng)味物質(zhì)驗證分析

通過功能性細菌單菌株發(fā)酵及配方組合混合發(fā)酵確定了在代謝典型風(fēng)味物質(zhì)方面的特征，現(xiàn)通過對比研究3種比例混合發(fā)酵在代謝四甲基吡嗪等典型風(fēng)味物質(zhì)方面的性能，即比例A：經(jīng)過化整的優(yōu)化組合8（即5株強化細菌組合1#∶3#∶139#∶146#∶151#=10∶35∶25∶20∶10）；比例B：10株細菌（1#、2#、3#、4#、35#、102#、109#、139#、146#、149#）等比例；比例C：5株強化細菌組合（1#∶3#∶139#∶146#∶151#=10∶35∶25∶20∶10）與7株細菌9∶1混合發(fā)酵；發(fā)酵結(jié)束運用頂空固相微萃取聯(lián)合氣質(zhì)聯(lián)用儀測定典型風(fēng)味化合物含量，結(jié)果見表4。

表4 A/B/C 3種不同比例細菌麩曲典型風(fēng)味化合物比對

由表4可知，比例A在四甲基吡嗪代謝方面具有非常強的優(yōu)勢性能，48 h代謝產(chǎn)量達到130.85×10-10g/g，即化整后的組合8中的5株菌以比例A（1#∶3#∶139#∶146#∶151#=10∶35∶25∶20∶10）進行的固態(tài)混合發(fā)酵，代謝四甲基吡嗪方面確實具有優(yōu)勢性能，與2.2中趨勢具有一致性，但是其產(chǎn)量的37倍多，同時4-乙烯基愈創(chuàng)木酚含量達到68.94×10-10g/g。

2.3 不同發(fā)酵條件下功能性細菌典型風(fēng)味物質(zhì)綜合分析

對功能性細菌純種發(fā)酵、配方組合混合發(fā)酵、強化菌株混合發(fā)酵，及實際生產(chǎn)中的細菌曲、混合曲氣質(zhì)聯(lián)用檢測的典型風(fēng)味物質(zhì)進行綜合分析，結(jié)果見表5。

表5 不同形式下功能性細菌風(fēng)味物質(zhì)含量

由表5可知，就典型性風(fēng)味化合物四甲基吡嗪而言，單株細菌固態(tài)麩曲發(fā)酵139#菌代謝四甲基吡嗪能力在12株菌中最強，為23.45×10-10g/g，進行配方組合優(yōu)化時四甲基吡嗪含量最高的是組合8（即1#∶3#∶109#∶139#∶146#∶151#=6∶36∶1∶11∶21∶26），四甲基吡嗪產(chǎn)量達到3.49×10-10g/g，低于純種發(fā)酵條件下139#的產(chǎn)量，說明功能性細菌之間的交互作用影響典型風(fēng)味化合物的代謝，但是在比例A即5株菌（1#∶3#∶139#∶146#∶151#=10∶35∶25∶20∶10）混合發(fā)酵時四甲基吡嗪產(chǎn)量達到130.85×10-10g/g，是純種139#菌發(fā)酵的6倍，是6株菌混合發(fā)酵即組合8的40倍，說明適宜菌種與適宜比例的混合發(fā)酵對代謝四甲基吡嗪方面具有一定優(yōu)勢，同時也可以說明109#菌對混合發(fā)酵的四甲基吡嗪代謝具有一定的抑制作用；并且比例A混合發(fā)酵情況下其他典型風(fēng)味化合物的含量如三甲基吡嗪、愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚都達到了最高水平。實際生產(chǎn)中的細菌曲（1#、2#、3#、4#、35#、102#、109#、139#、146#、149#等比例）四甲基吡嗪產(chǎn)量達到51.33×10-10g/g，而實驗室條件下（1#、2#、3#、4#、35#、102#、109#、139#、146#、149#等比例）四甲基吡嗪產(chǎn)量高達113.75×10-10g/g（表4），后者是前者的2.2倍，說明實際生產(chǎn)中和實驗室條件下四甲基吡嗪產(chǎn)量差距較大，同樣的菌種、同樣的比例在實際生產(chǎn)中由于生產(chǎn)的不可控因素影響了四甲基吡嗪等風(fēng)味物質(zhì)的代謝；同時，實際生產(chǎn)中的混合曲四甲基吡嗪產(chǎn)量為7.60×10-10g/g，是實際生產(chǎn)條件下細菌曲的1/6.8倍，與復(fù)混比例基本具有一致性。

3 結(jié)論

本實驗研究了綿柔型白酒釀造用功能性細菌風(fēng)味化合物代謝情況：首先，通過對12株功能性細菌單菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)風(fēng)味化合物的定性定量分析可知，功能性細菌代謝產(chǎn)生的風(fēng)味化合物數(shù)量和種類非常豐富，主要集中在醛類、酮類、吡嗪類化合物、多元醇、烯醇類、芳香族化合物、呋喃類化合物及其他雜環(huán)化合物等，還有少量的酸類、酯類、噻唑、噻吩、吡啶、吡咯化合物；其中吡嗪類化合物主要有三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2, 4-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基-6-乙基吡嗪、2-乙基-3，5-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪等，其中139#菌代謝四甲基吡嗪能力在12株菌中最強，為23.45×10-10g/g，確立了不同菌株代謝不同風(fēng)味化合物優(yōu)勢性能；其次，通過對選取的6株優(yōu)勢菌株進行混合發(fā)酵配方組合研究以及不同比例情況下的對比驗證，確定了比例A即5株菌（1#∶3#∶139#∶146#∶151#=10∶35∶25∶20∶10）混合發(fā)酵時四甲基吡嗪產(chǎn)量最高，為130.85×10-10g/g，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚達到68.94（×10-10g/g），建立了典型菌株混合發(fā)酵代謝典型風(fēng)味化合物的最佳配比組合；進一步通過對不同發(fā)酵條件下功能性細菌典型風(fēng)味物質(zhì)綜合分析可知，適宜菌種適宜比例的混合發(fā)酵在代謝四甲基吡嗪等典型風(fēng)味化合物方面具有一定優(yōu)勢，比例A代謝三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚以及β-苯乙醇均達到了最高水平，建立了典型菌株混合發(fā)酵代謝典型風(fēng)味化合物的最佳配比組合。

通過本研究確定了功能性細菌在純種發(fā)酵和組合發(fā)酵代謝以四甲基吡嗪為主的典型風(fēng)味化合物的優(yōu)勢，為促進綿柔型白酒釀造用復(fù)合功能曲制曲工藝的提升及改進奠定了基礎(chǔ)，對綿柔型白酒調(diào)味酒及綿柔型白酒生產(chǎn)具有重要意義。

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Metabolites of Functional Bacteria for Soft-Flavor Baijiu Production

ZHANG Congzhi,ZHANG Longyun,LIYanrong and PU Chun
(Yanghe Distillery Co.Ltd.,Suqian,Jiangsu 223800,China)

In this study,the metabolites of functional bacteria for soft-flavor Baijiu production were investigated.The metabolic flavoring compounds from different bacteria strains were identified.Through the analysis of the ratio of different flavoring compounds,the optimum ratio of different bacteria strains for mixed fermentation was determined.Furthermore,the content of the metabolic flavoring compounds under different fermenting conditions was com pared.The preponderance of metabolic tetramethyl pyrazineetc.in mixed fermentation w as revealed.

soft-flavor Baijiu;functional bacteria;flavoring compounds;tetramethyl pyrazine

TS262.3；TS261.1；TS261.4

A

1001-9286（2017）02-0040-04

10.13746/j.njkj.2016152

2016-05-03；

2016-12-09

張聰芝（1986-），男，山東高唐人，碩士研究生，主要從事釀酒微生物選育、發(fā)酵性能及風(fēng)味化合物研究，E-mail：congw dyx@126.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2017-01-04；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170104.1401.002.htm l。