王少凈+張衛(wèi)麗+劉新鑫+杜亞茹+王冰肖+李忠徽+閆寧寧+李書粉+高武軍+鄧傳良

摘要：菠菜（Spinacia oleracea L）是研究雌雄異株植物性別分化的模式材料，其性別分化不但受到性別決定基因的控制，還受到環(huán)境條件的影響，干旱是其中的一個重要因素，但是關(guān)于聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）模擬土壤干旱環(huán)境對菠菜性別分化影響的分子機制目前尚未見報道。試驗以日本大葉菠菜（S. oleracea cv. Japanese leaves）為供試材料，利用不同濃度的PEG6000進行處理，研究干旱環(huán)境對菠菜性別分化的影響。采用溫室盆栽種植方式，分別用5%、10%的PEG6000模擬土壤干旱環(huán)境對盆栽菠菜處理72 h，處理株數(shù)均為100株，并同時設(shè)置對照組。結(jié)果表明，與對照組雌雄比例（0.96）相比，PEG6000 5%處理組的雌雄比例（1.09）與10%處理組（0.97）均接近于對照組；對發(fā)生性反轉(zhuǎn)數(shù)進行統(tǒng)計，結(jié)果表明，PEG6000 10%處理組低于5%處理組；利用菠菜Y染色體緊密連鎖的雄性特異標記T11A對處理前、后的植株進行鑒定，發(fā)現(xiàn)菠菜植株出現(xiàn)了性反轉(zhuǎn)現(xiàn)象，且均為雌株轉(zhuǎn)變?yōu)樾壑?。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，性反轉(zhuǎn)后，雄性特異條帶也隨之出現(xiàn)。試驗首次對PEG6000模擬土壤干旱環(huán)境對菠菜性別分化影響的分子機制進行了探究，其研究結(jié)果對于進一步揭示菠菜性別分化機理具有重要意義。

關(guān)鍵詞：菠菜（Spinacia oleracea L）；聚乙二醇；T11A分子標記；性反轉(zhuǎn)；性別分化

中圖分類號：S636.1：Q344+.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）20-5275-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.027

Abstract： Spinacia oleracea L is the model material for studying the sex differentiation of dioecious plants. Sex differentiation of dioecious plants was controlled not only by the sex-determining gene but also affected by environmental conditions， of which drought is one of the important factors. However， the molecular mechanism of the effect of drought stress on S. oleracea sex differentiation under polyethylene glyco（PEG） treatment has not been reported. Taking S. oleracea cv. Japanese leaves as material， treating with different concentration of PEG6000， the effect of drought stress on S. oleracea gender differentiation was studied. Potting plants in greenhouse， 200 plants were treated by 5% and 10% PEG6000 respectively while the control group was treated using water. After 72 h， the male and female ratio of treated groups was compared with that of control group （0.96）. the results showed that the female-to-male ratio of 5% PEG6000 treatment （1.09） and 10% PEG6000 treatment（0.97） are close to that of the control group. The statistics showed that the sex-reversal number of 10% PEG6000 treatment was lower than that of 5% PEG6000 treatment. Using the Y chromosome linked male specific molecular markers T11A to identify the S. oleracea sex phenomenon before and after PEG6000 treatment， the results showed that the female-to-male sex reversal phenomenon happened. Agarose gel electrophoresis results showed that after female-to-male sex reversal， male specific bands also emerged. The molecular mechanism of the effect of drought stress on spinach sex differentiation under PEG6000 treatment were studied for the first time， which has great significance for further inquiry to the S. oleracea gender differentiation mechanism.

Key words： Spinacia oleracea L； polyethylene glyco； molecular markers of T11A； sex reversal； gender differentiation

菠菜（Spinacia oleracea L.）為藜科（Chenopodiaceae）菠菜屬（Spinacia L.）一年生或二年生的雌雄異株植物，染色體組成為（2n=2x=12），其是研究植物雌雄異株性別分化分子機制的模式材料。性反轉(zhuǎn)現(xiàn)象在自然界中是普遍存在的，研究表明，在干旱、養(yǎng)分缺乏、重金屬、鹽脅迫以及全球氣候變化等環(huán)境脅迫下，雌雄異株植物的性別響應(yīng)會出現(xiàn)差異[1]。這種現(xiàn)象在動物中也很常見，如在低等動物（如魚、黃鱔和某些爬行動物）中由于溫度等外界環(huán)境因素的改變可引起性反轉(zhuǎn)[2]；在哺乳動物中同樣存在性反轉(zhuǎn)現(xiàn)象，陶志云等[3]認為哺乳動物性反轉(zhuǎn)是由生殖腺及由此引起的表型性征改變而產(chǎn)生的，而染色體組型是不改變的。此外，鄭江霞等[4]發(fā)現(xiàn)鳥類性別決定候選基因可以在性反轉(zhuǎn)雞胚中表達。菠菜作為雌雄異株植物，其性別分化也極易受到外界環(huán)境因素的影響[5]；然而關(guān)于外界因素對雌雄異株植物菠菜性別分化影響的分子機理目前尚不清楚。在早期研究中，Penel等[6]、曹宗巽等[5]等均發(fā)現(xiàn)菠菜性別差異與過氧化物酶同工酶有關(guān)。近年來，有學者通過核型分析[7，8]、性染色體顯微分離[9]、同工酶技術(shù)[10]、RAPD分子標記[11，12]、EST-SSR標記[13]等方法對菠菜的性別分化進行了多角度研究。

聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）是一種滲透調(diào)節(jié)劑，常被用作植物水分脅迫劑來模擬土壤干旱環(huán)境。其原理是利用惰性的、非離子型的滲透調(diào)節(jié)劑PEG人為模擬水分滲透脅迫來進行抗旱研究，PEG自身不能通過植物細胞壁滲入活細胞內(nèi)，且無活性；但能使細胞緩慢吸水[14]。由于該方法條件易控制、重復(fù)性好、周期短、操作簡便，因而已應(yīng)用于油菜、棉花、玉米等作物。國內(nèi)外有關(guān)PEG模擬干旱環(huán)境對植物的內(nèi)源激素變化、酶變化、植物生理生化反應(yīng)[15]和植物種子萌發(fā)都有報道，如楊景寧等[16]及宋鑫玲等[14]分別研究了PEG對植物種子萌發(fā)的影響。此外，雌雄植株性別間對干旱脅迫的敏感性和耐受性存在明顯的物種間差異[17]。目前，使用PEG對菠菜性別分化的影響未見報道。為此，試驗利用PEG6000模擬干旱環(huán)境，觀察在不同滲透脅迫條件下菠菜植株性別比例差異以及性反轉(zhuǎn)現(xiàn)象，并利用菠菜Y染色體緊密連鎖的雄性特異分子標記T11A對發(fā)生性反轉(zhuǎn)的植株進行鑒定，以期為進一步揭示菠菜性別分化分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2013-2014年，在河南師范大學植物組織培養(yǎng)室進行盆栽菠菜試驗，品種為日本大葉菠菜（S. oleracea cv. Japanese leaves）。種植前將種子人工春化（4 ℃冰箱處理7 d左右）處理，然后播種于培養(yǎng)土和蛭石（1∶1.5）混合基質(zhì)的花盆中，并保持濕潤。培養(yǎng)條件為每天14～16 h光照、黑暗8～10 h的長日照，均用日光燈照明，經(jīng)照度計檢測，光照度為3 000 lx，室內(nèi)溫度控制在20 ℃，直至全部正常開花。

1.2 PEG6000處理

將種植的菠菜植株隨機分為3組，PEG6000處理有2組，濃度分別為5%和10%，對照（空白）為1組，每組均為100株，并貼上相應(yīng)的標簽。分別利用PEG6000濃度為5%和10%的溶液對每株菠菜根部進行澆灌，每株澆約30～40 mL；對照組則正常澆水。處理后，每天定期觀察菠菜植株的生長變化，并對比拍照。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)10%處理組處理3 d時開始出現(xiàn)枯萎死亡的現(xiàn)象，此時開始對2組處理組進行復(fù)水，隨后均正常澆水，直至全部植株正常開花。由于每株植株開花時間略有差異，因此每隔2 d對菠菜開花結(jié)果情況進行一次統(tǒng)計，統(tǒng)計方法嚴格按照菠菜雌雄植株開花特點，并準確區(qū)分絕對雌株、絕對雄株及兩性株。直至處理組和對照組菠菜均全部正常開花為止。

1.3 性反轉(zhuǎn)的分子檢測

為了揭示性反轉(zhuǎn)的分子機制，試驗進行了如下處理：在PEG6000處理之前，對培養(yǎng)大約2周的菠菜剪取葉片，用改良的2×CTAB法提取每株菠菜的DNA[18，19]，用菠菜Y染色體緊密連鎖的雄性特異分子標記T11A[20]鑒定菠菜的原始性別，引物T11A上游序列（T11A F）為：5′-CCCTAATTAACTCCTCTTTACCCAA-3′；下游序列（T11A R）為：5′-TACAA- GCCCCATTATCATAACAGTC-3′；T11A反應(yīng)體系（20 μL）為：上游引物P1 0.5 μL，下游引物P2 0.5 μL，H2O 14.4 μL，Buffer 2 μL，dNTPs 1.5 μL，Taq DNA聚合酶0.1 μL；其擴增程序為：94 ℃、2 min，94 ℃、 15 s，56 ℃、30 s，72 ℃、1 min，72 ℃、10 min，4 ℃恒溫。另外，對利用PEG6000濃度為5%和10%的溶液處理后菠菜植株開花情況進行性別統(tǒng)計，將統(tǒng)計的結(jié)果與處理前鑒定的菠菜原始性別進行比較，找出發(fā)生性反轉(zhuǎn)的植株，保存葉片，提取DNA，并再次利用T11A對性反轉(zhuǎn)植株進行鑒定，借助瓊脂糖凝膠電泳方法檢測處理前后的條帶變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG6000處理對菠菜性別分化的影響

試驗對3個處理組菠菜植株開花的統(tǒng)計分析情況見表1。從表1可見，與對照組雌雄比例（0.96）相比，5%處理組（1.09）與10%處理組（0.97）的雌雄比例均接近于對照組，表明PEG6000處理對性別比例影響不大。與處理前菠菜原始性別相比較，發(fā)現(xiàn)PEG6000處理可以導(dǎo)致菠菜植株發(fā)生性反轉(zhuǎn)，其中10%處理組的性反轉(zhuǎn)比例低于5%處理組。

2.2 性反轉(zhuǎn)的分子檢測

利用菠菜Y染色體緊密連鎖的雄性特異分子標記T11A對PEG6000溶液2個濃度處理前、后的植株進行鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分別見圖1、圖2。從圖1、圖2可見，PEG6000處理的菠菜植株出現(xiàn)了性反轉(zhuǎn)現(xiàn)象，且均為雌株轉(zhuǎn)變?yōu)樾壑辍Ｐ苑崔D(zhuǎn)后，雄性特異條帶也隨之出現(xiàn)。

3 討論

菠菜性別分化不但受到性別決定基因的控制，還受到外界環(huán)境影響。在早期研究中，Chailkhyan等[21]認為在長日照類型的菠菜中，GA3對性別表現(xiàn)的影響為促進雄性化，Gizawy等[22]、Sherry等[23]也都認為GA3處理有促雄作用；而曹宗巽等[5]則報道GA3在菠菜中有促雌作用。干旱作為一種重要的環(huán)境影響因子，對菠菜性別分化的影響還未見相關(guān)報道。PEG作為一種高分子滲透調(diào)節(jié)劑或水分脅迫劑，可以降低水勢，添加在栽培菠菜的土壤中能夠模擬干旱環(huán)境。從試驗結(jié)果來看，PEG滲透溶液對菠菜植株性別分化產(chǎn)生了一定程度的影響，但不同濃度PEG處理對菠菜性別分化產(chǎn)生的影響差異不大，只是均可以產(chǎn)生性反轉(zhuǎn)現(xiàn)象。

試驗結(jié)果表明，PEG模擬土壤干旱環(huán)境作為一種誘導(dǎo)信號更有利于使菠菜由雌株向雄株方向轉(zhuǎn)化。利用菠菜Y染色體緊密連鎖的雄性特異分子標記T11A對處理前后的基因組進行檢測表明，在雌性植株轉(zhuǎn)變?yōu)樾壑甑倪^程中，雄性特異條帶隨之出現(xiàn)。菠菜性別反轉(zhuǎn)的機制可能是PEG6000為一種誘導(dǎo)信號，菠菜細胞表面具有信號受體蛋白，信號受體蛋白在接受信號后，作為一種反式作用因子，激活了菠菜性別決定基因Y的表達，從而使得菠菜由雌株轉(zhuǎn)變?yōu)樾壑?。因此，T11A分子標記作為Y染色體緊密連鎖雄性特異標記，可以作為鑒別菠菜性別的非常穩(wěn)定的標記[20]。在后期研究過程中，可以利用抑制性消減雜交技術(shù)對PEG處理前、后基因組的表達差異進行比較，從而探討處理后性別相關(guān)基因是否完全表達。

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