付春鵬

(山東省濰坊科技學(xué)院 262700)

基因是生命遺傳的基本單位。由數(shù)以億計(jì)的堿基對組成的基因組，蘊(yùn)藏了生命體遺傳信息的奧秘。對核酸序列進(jìn)行測序是正確解讀這部“天書”的基礎(chǔ)，也是最為關(guān)鍵的一步。迄今，測序技術(shù)共經(jīng)歷了四代變革。20 世紀(jì) 70 年代出現(xiàn)了第一代經(jīng)典的Sanger測序技術(shù)，人類基因組計(jì)劃的實(shí)施推動了邊合成邊測序的第二代測序技術(shù)的誕生及發(fā)展，近幾年分別以單分子和納米孔測序?yàn)闃?biāo)志的第三和第四代測序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。其中第二、第三和第四代測序技術(shù)統(tǒng)稱為下一代測序(next generation sequencing，NGS)技術(shù)。本文概述了這些測序技術(shù)的基本原理及特點(diǎn)。

1 第一代測序技術(shù)

早在1954年，Whitfeld就已經(jīng)報(bào)道使用層析法測定了多聚核糖核苷酸的序列。第一代測序技術(shù)的標(biāo)志是Sanger 于1977 年發(fā)明的 DNA 雙脫氧核苷酸末端終止測序法，以及Maxam和Gilbert 于同年發(fā)明的DNA化學(xué)降解測序法[1]。其中，Sanger法的核心原理是：由于ddNTP的2′和3′都不含羥基，在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應(yīng)。在4個DNA合成反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標(biāo)記的ddNTP(分別為：ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP)，通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列[2]。Sanger 測序技術(shù)操作快速、簡單，因此被廣泛應(yīng)用。20世紀(jì)80年代末，熒光標(biāo)記技術(shù)憑借著更加安全簡便的特性，逐步取代同位素標(biāo)記技術(shù)，由此也誕生了自動化測序技術(shù)。由于可以用不同熒光標(biāo)記4種ddNTP，使得最后產(chǎn)物的電泳分離過程可以在一個泳道內(nèi)實(shí)現(xiàn)，用激光對ddNTP上的熒光標(biāo)記進(jìn)行激發(fā)，然后檢測不同波長的信號，通過計(jì)算機(jī)處理信號后即可獲得堿基序列，很好地解決了原技術(shù)中不同泳道遷移率存在差異的問題。自動化儀測序大大提高了測序效率，如ABI 3730 和 Amersham MegaBACE 測序儀分別可以在一次運(yùn)行中分析 96 個或 384 個樣本。第一代測序儀在人類基因組計(jì)劃 DNA 測序的后期階段起到了關(guān)鍵的作用，使人類基因組計(jì)劃比原計(jì)劃提前兩年完成。但第一代測序技術(shù)存在成本高、通量低、耗時(shí)長的缺點(diǎn)，嚴(yán)重影響了其大規(guī)模應(yīng)用[3]。

2 第二代測序技術(shù)

目前最具代表性的第二代測序平臺包括：瑞士羅氏公司(Roche)的 454測序儀、美國 Illumina公司的Solexa基因組測序儀、美國 ABI 公司的SOLiD測序儀等。第二代測序技術(shù)的原理是邊合成邊測序，即依照第一代 Sanger 測序技術(shù)的原理，通過測序儀器捕捉新?lián)饺氲哪┒藷晒鈽?biāo)記來確定DNA 序列組成[4]。

Solexa 測序的核心技術(shù)是 DNA 簇和可逆終止化學(xué)反應(yīng)。測序前先將模板樣品DNA片段打碎形成100～200 bp的片段，然后在這些片段兩端加上特定的測序接頭。而Solexa高通量測序芯片表面附著一層單鏈引物，兩端連有接頭的單鏈 DNA 片段通過與芯片表面的引物堿基互補(bǔ)結(jié)合，經(jīng)PCR擴(kuò)增成為雙鏈。至此DNA 的一端就被錨定在測序芯片上，而另一端則隨機(jī)和附近的引物互補(bǔ)結(jié)合，從而也被固定住，形成“橋”式結(jié)構(gòu)。 這樣經(jīng)過反復(fù) 30 輪擴(kuò)增循環(huán)后，每個DNA片段得到約 1 000 倍擴(kuò)增，形成單克隆 DNA 簇。然后摻入經(jīng)過改造的 DNA 聚合酶和帶有 4 種熒光標(biāo)記的dNTP。 這些dNTP就是“可逆終止子”，其3′羥基端帶有可化學(xué)切割的部分，每個循環(huán)只允許摻入1個堿基，用激光掃描測序芯片表面，讀取聚合上去的相關(guān)核苷酸種類。隨后將這些核苷酸化學(xué)切割，恢復(fù)3′端黏性，繼續(xù)聚合下一個核苷酸。如此循環(huán)，直至每條模板序列都被聚合成雙鏈。此過程中帶有熒光標(biāo)記的 dNTP能夠釋放出相應(yīng)的熒光，測序儀據(jù)此捕捉熒光信號，之后計(jì)算機(jī)可以將熒光信號轉(zhuǎn)化為不同顏色的測序峰圖，便可得知測序樣品的DNA序列。

較第一代測序技術(shù)而言，第二代測序技術(shù)的測量通量顯著提高，是目前市場上主流的測序技術(shù)。但邊合成邊測序的原理也為其帶來相應(yīng)不足之處，測序讀長較短和需要模板擴(kuò)增是兩個主要的弊端所在。第二代測序的讀長一般在700 bp左右，為后續(xù)的序列拼接、組裝及注釋等生物信息學(xué)分析帶來了較大困難；由于PCR反應(yīng)的靈敏性，導(dǎo)致擴(kuò)增前后得到的 DNA 分子片段的數(shù)目有較大偏差，因此在分析基因表達(dá)方面存在較大的弊端[5]。在此基礎(chǔ)上，無需擴(kuò)增、讀長更長的第三代測序技術(shù)便應(yīng)運(yùn)而生。

3 第三代測序技術(shù)

第三代測序技術(shù)基于單分子讀取技術(shù)，不需要PCR擴(kuò)增，具有巨大的應(yīng)用前景?，F(xiàn)有的第三代測序平臺包括美國 Helicos Bioscience 公司的HeliScope遺傳分析系統(tǒng)和Pacific Biosciences公司的單分子實(shí)時(shí)測序系統(tǒng)(SMRT)。兩者均繼承了第二代測序技術(shù)的邊合成邊測序的原理，其中SMRT系統(tǒng)是基于零級波導(dǎo)(zero-mode waveguide, ZMW)的測序技術(shù)。ZMW是一種直徑50～100 nm、深約100 nm的孔狀納米光電結(jié)構(gòu)，當(dāng)光線進(jìn)入后呈指數(shù)衰減，僅靠近基底的部分被照亮。DNA聚合酶被固定在ZMW底部，加入模版、引物和4色熒光標(biāo)記的dNTP后進(jìn)行DNA合成，只有參加反應(yīng)的dNTP 才能停留在ZMW底部，從而使dNTP的熒光信號被識別[6]。

第三代測序技術(shù)是計(jì)算機(jī)學(xué)、生物學(xué)、化學(xué)等多個學(xué)科領(lǐng)域研究相結(jié)合的結(jié)晶，功能非常強(qiáng)大。其顯著特點(diǎn)是單分子測序，即不經(jīng) PCR，可直接進(jìn)行邊合成邊測序。這不僅簡化了樣品處理過程，避免了擴(kuò)增可能引入的錯配，而且不受A、T、G、C 這4種堿基含量的影響，因此第三代測序技術(shù)能直接對RNA和甲基化DNA序列進(jìn)行測序。

4 第四代測序技術(shù)

第二、三代測序技術(shù)均是基于光信號的測序技術(shù)，都需要昂貴的光學(xué)監(jiān)測系統(tǒng)，并依賴 DNA 聚合酶讀取堿基序列，大大地增加了測序的成本。因此開發(fā)不使用生物化學(xué)試劑，直接讀取 DNA 序列信息的新型測序方法，就成為第四代測序技術(shù)的主要思想[7]。其中的代表當(dāng)屬納米孔測序，如英國Oxford Nanopore Technologies公司所開發(fā)的納米孔測序，是基于電信號的測序技術(shù)。它利用鑲嵌于脂質(zhì)雙分子層中的經(jīng)過基因工程改造過的α-溶血素蛋白作為納米孔道，孔內(nèi)共價(jià)結(jié)合有分子接頭。由于A、T、G、C這4 種堿基存在電荷差異，當(dāng)DNA堿基通過納米孔時(shí)，從而短暫地影響流過納米孔的電流強(qiáng)度(4種堿基所影響的電流變化幅度各不相同)，靈敏的電子設(shè)備檢測到這些變化從而鑒定所通過的堿基[4]。

雖然納米孔測序的優(yōu)點(diǎn)十分明顯，與前幾代技術(shù)相比在成本、速度方面有著很大優(yōu)勢。但是目前還處在起步階段，在關(guān)鍵環(huán)節(jié)(如納米孔的制造和 DNA 分子通過納米孔的速度控制方面)還有待改善。

5 展望

縱觀基因組測序技術(shù)的發(fā)展歷程可以看出，從第一代到第四代測序技術(shù)無一例外地均以提高測序通量與讀長、降低測序成本、簡化測序步驟為目標(biāo)[8]。目前全基因組測序的費(fèi)用仍舊高昂，動輒幾百萬元的測序費(fèi)用絕非一般實(shí)驗(yàn)室所能承擔(dān)。千元基因組甚至百元基因組測序一直是科學(xué)家追求的目標(biāo)。另外，測序技術(shù)也決不僅僅涉及生物學(xué)問題，它綜合了物理學(xué)、光學(xué)、電學(xué)和材料學(xué)等多種學(xué)科的知識，相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，符合上述要求的新一代的測序儀將會出現(xiàn)。屆時(shí)，人們對自身各個生化過程和疾病發(fā)生的分子機(jī)制等重大問題將會有更深刻細(xì)致的了解；對其他物種的生長發(fā)育、代謝調(diào)控、適應(yīng)環(huán)境和生殖遺傳等各種生物學(xué)過程將會有全新的認(rèn)識。