張佳麗，王彥輝，杜良偉

(1. 廣西大學(xué) 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南寧 530004; 2. 廣西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，南寧 530004； 3. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所， 南寧 530007)

阿特拉津的甘蔗內(nèi)生菌降解研究

張佳麗1,2，王彥輝3，杜良偉1,2

(1. 廣西大學(xué) 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南寧 530004; 2. 廣西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，南寧 530004； 3. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所， 南寧 530007)

從廣西長(zhǎng)期施用阿特拉津的甘蔗田中的甘蔗根部成功篩選到一株降解阿特拉津的內(nèi)生菌N-2。根據(jù)該降解菌的形態(tài)特征，結(jié)合其18S rRNA及ITS序列的測(cè)定結(jié)果，將其鑒定為藤倉(cāng)鐮孢霉菌，該菌株對(duì)阿特拉津的降解為首次報(bào)道。同時(shí)還考察了菌株的降解特性，結(jié)果表明其以阿特拉津作為唯一氮源，在pH 7～8，培養(yǎng)溫度28℃，初始阿特拉津濃度25 mg/L時(shí)，對(duì)阿特拉津的降解效果最佳，10 d降解率可達(dá)49.6%。利用超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS)分析了阿特拉津的降解產(chǎn)物，測(cè)定結(jié)果表明，該菌株降解阿特拉津的產(chǎn)物為氰尿酸。

阿特拉津；生物降解；植物內(nèi)生菌；降解特性

阿特拉津是一種三氮雜苯類(lèi)除草劑[1]，由于長(zhǎng)期廣泛地使用，已經(jīng)對(duì)土壤、水體等環(huán)境造成了嚴(yán)重污染[2]。其常在土壤[3]、地表水[4]及地下水[5]中被檢測(cè)到，這些殘留將直接影響土壤中植物[6]和水生植物[7]的生長(zhǎng)，同時(shí)還可通過(guò)食物鏈富集危害動(dòng)物[8-9]及人類(lèi)健康[10-11]。目前，可有效去除阿特拉津殘留的方法主要包括物理去除、化學(xué)降解及生物降解法。物理去除中常用的活性炭吸附法[12]存在機(jī)械強(qiáng)度差及不易重復(fù)利用的缺點(diǎn)，膜處理技術(shù)[13]則對(duì)水體要求較高且易造成膜堵塞。常見(jiàn)化學(xué)降解有Fenton或類(lèi)Fenton法[14]、電化學(xué)法[15]、臭氧氧化法[16]、γ輻照法[17]等，但因成本較高，反應(yīng)條件苛刻及易對(duì)環(huán)境造成二次污染等問(wèn)題使其在應(yīng)用上受到了一定的限制。而生物降解法[18-19]成本較低，且無(wú)需復(fù)雜的處理設(shè)備，相較于物理、化學(xué)方法所產(chǎn)生的二次污染是更為安全、可行的方法[20]。目前在生物降解方面，國(guó)內(nèi)外研究者主要從土壤或活性污泥中篩選阿特拉津的降解菌株并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)研究[21]，而在寡營(yíng)養(yǎng)條件下，從植物組織內(nèi)篩選分離出阿特拉津的降解菌株鮮有報(bào)道。本研究從甘蔗根內(nèi)篩選能夠降解阿特拉津的內(nèi)生菌株，并加以鑒定，考察降解菌株對(duì)阿特拉津的降解特性，分析其降解產(chǎn)物,以期為其在生物降解中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與試劑

LB培養(yǎng)基；PDA培養(yǎng)基；基礎(chǔ)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基MS(g/L)：KH2PO40.9，Na2HPO42.6，MgSO4·7H2O 0.2，NaCl 0.5，glucose 5；固體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：MS+Agar 15 g/L；提取DNA培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨3，酵母提取物0.5，glucose 10，K2HPO44，CaCl20.35，MgSO4·7H2O 0.3。

阿特拉津原藥(純度≥99%)購(gòu)自Dr. Ehrenstorfer GmbH(Germany)；甲醇，HPLC級(jí)(New Jersey，USA)；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 降解菌株的篩選

從廣西甘蔗種植區(qū)采集甘蔗根樣品，對(duì)甘蔗根表面滅菌。將沖洗干凈后的甘蔗根依次在75%的酒精浸泡3 min、3%的次氯酸鈉溶液中浸泡5 min后，用無(wú)菌水反復(fù)沖洗根表面，無(wú)菌濾紙吸干，取最后一次淋洗液涂布于LB和PDA平板中，分別于37℃和28℃下恒溫培養(yǎng)5 d，用于檢測(cè)甘蔗根表面滅菌是否徹底，若LB與PDA平板均未有菌落生成，則說(shuō)明根表面已徹底滅菌。

將已表面滅菌的甘蔗根置于無(wú)菌研缽中，加入滅菌水充分研磨勻漿，靜置10 min后，取上清液涂布于含有阿特拉津的固體培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)。不斷改變培養(yǎng)基中阿特拉津的濃度，直至培養(yǎng)基中有菌落生成。將生成的單菌落接種于含有阿特拉津的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行反復(fù)多次的培養(yǎng)，直至菌株能穩(wěn)定地在以阿特拉津作為唯一氮源的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，從而篩選出具有降解阿特拉津特性的菌株。

1.3 降解菌株的鑒定

用接種針挑取PDA平板上的菌絲在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲和孢子形態(tài)。18S rRNA和ITS基因克隆參照文獻(xiàn)[22]進(jìn)行。18S rRNA擴(kuò)增的正向引物NS1：5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′，反向引物Fung：5′-ATTCCCCGTTACCCGTTG-3′。ITS擴(kuò)增的正向引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′，反向引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。25 μL PCR反應(yīng)體系為：10×EXTaqBuffer, 2.5 μL；DNTP(2.5 mmol/L), 1 μL；NS1(10 μmol/L), 1 μL；Fung(10 μmol/L), 1 μL；總DNA 2 ng；EXTaq, 0.25 μL。擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性5 min；98℃變性30 s，58℃/55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京華大公司測(cè)定基因序列。將測(cè)序結(jié)果在GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)分析。

1.4 阿特拉津降解率的測(cè)定

為考察菌株的降解特性，分別設(shè)置不同的降解條件后接種菌株進(jìn)行培養(yǎng)，包括降解時(shí)間、pH值、培養(yǎng)溫度、初始阿特拉津濃度。待菌株降解完成后，加入等體積氯仿進(jìn)行萃取，收集有機(jī)相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于45 ℃下濃縮至近干，用色譜純的甲醇定容后用HPLC檢測(cè)。參考文獻(xiàn)[23]設(shè)定檢測(cè)條件：250 mm × 4.6 mm C18不銹鋼色譜柱，流動(dòng)相甲醇/水(80/20,V/V)，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，Waters 2495紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)222 nm。檢測(cè)結(jié)束后，記錄吸收峰面積，根據(jù)阿特拉津的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算殘余阿特拉津濃度，從而計(jì)算出降解率。

1.5 阿特拉津降解產(chǎn)物的測(cè)定

待降解完成后，用UPLC-MS測(cè)定產(chǎn)物。參考文獻(xiàn)[24]設(shè)定MS條件：離子源為ESI，模式為Positive/Negative，離子捕獲器范圍為80～250m/z，霧化器電壓為30 V(N2溫度350℃)，毛細(xì)管電壓3.5 kV。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌株的篩選與鑒定

從甘蔗根組織內(nèi)篩選到一株內(nèi)生菌株N-2，能利用阿特拉津作為唯一氮源穩(wěn)定地生長(zhǎng)。該降解菌株在PDA平板上為白色菌絲體，氣生菌絲呈棉絮狀致密生長(zhǎng)，在平板表面產(chǎn)生少量淡紫紅色色素。在光學(xué)顯微鏡下對(duì)該菌株的菌絲體及孢子進(jìn)行觀察，該菌株的菌絲體呈長(zhǎng)桿狀，有短分枝無(wú)規(guī)則分布于桿狀體上，產(chǎn)生的孢子為桿柱型，兩端稍尖。18S rRNA和ITS序列的擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。測(cè)序后進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示該菌株的18S rRNA和ITS序列與藤倉(cāng)鐮孢菌的相似性達(dá)99%以上。結(jié)合該菌株的形態(tài)特征，初步將其鑒定為藤倉(cāng)鐮孢霉菌(Fusariumfujikuroi)。

圖1 菌株P(guān)CR產(chǎn)物Fig 1 The PCR products of the strain

A：18S rRNA序列；B：ITS序列

2.2 菌株的降解特性研究

2.2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株降解的影響

配制含有25 mg/L阿特拉津的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，將1×106CFU/mL的孢子懸液以接種量1%于培養(yǎng)基中接入N-2，于28℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)，分別于第0、2、4、6、8、10及第12天取樣，經(jīng)過(guò)萃取預(yù)處理后，用HPLC檢測(cè)殘余阿特拉津濃度，計(jì)算降解率。結(jié)果表明(圖2)，前6天內(nèi)，其降解率處于較低水平,第6～8天內(nèi)，降解率以較高的速率增長(zhǎng)，隨后阿特拉津的降解速率開(kāi)始下降，第10天時(shí)，其降解率為45.86%，隨后降解速率已十分緩慢。根據(jù)此實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將后續(xù)實(shí)驗(yàn)中阿特拉津的降解天數(shù)設(shè)定為10 d。

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)降解阿特拉津的影響Fig 2 Effect of incubation time on degradation rate

圖3 pH值對(duì)降解阿特拉津的影響Fig 3 Effect of pH on degradation rate

2.2.2 pH值對(duì)菌株降解效果的影響

將培養(yǎng)液調(diào)節(jié)pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，接菌培養(yǎng)10 d后計(jì)算降解率。結(jié)果表明(圖3)，在pH 4.0～7.0的范圍內(nèi)，阿特拉津的降解率隨著pH值的增加而增加，在pH 7.0時(shí)，降解率達(dá)到峰值為44.07%，在pH 7.0～10.0的范圍內(nèi)，阿特拉津的降解率隨著pH值的增加而減少。由此可見(jiàn)，N-2在中性環(huán)境中降解阿特拉津的效率最佳。

2.2.3 溫度對(duì)菌株降解效果的影響

將接菌后的培養(yǎng)液分別置于16℃、22℃、28℃、34℃和40℃下培養(yǎng)10 d后計(jì)算降解率。結(jié)果顯示(圖4)，N-2在16℃～34℃的條件下對(duì)阿特拉津均有一定程度的降解，溫度由16℃逐漸升高至28℃時(shí)，阿特拉津的降解率逐漸增加至48.44%，之后隨著溫度的繼續(xù)升高，降解率呈迅速下降的趨勢(shì)，至40℃時(shí)，N-2對(duì)阿特拉津的降解效果已微乎其微。

圖4 培養(yǎng)溫度對(duì)降解阿特拉津的影響Fig 4 Effect of temperature on degradation rate

2.2.4 阿特拉津的初始濃度對(duì)N-2降解的影響

分別配制阿特拉津初始濃度為5、10、25、40和60 mg/L的培養(yǎng)液，接菌培養(yǎng)10 d后計(jì)算降解率。結(jié)果表明(圖5)，當(dāng)阿特拉津的初始濃度為5 mg/L時(shí)，阿特拉津幾乎沒(méi)有被降解，10 mg/L時(shí)的降解率只有4.42%，分析可能是由于培養(yǎng)基中較低濃度的阿特拉津并不能給降解菌提供足夠的營(yíng)養(yǎng)，影響了其生長(zhǎng)與繁殖，間接影響了其對(duì)阿特拉津的利用與降解率。當(dāng)阿特拉津的初始濃度達(dá)到25 mg/L時(shí)，阿特拉津已能被降解菌株有效地降解。隨后繼續(xù)增大培養(yǎng)基中阿特拉津的初始濃度，降解率呈下降趨勢(shì)，到60 mg/L時(shí)，降解率只剩9.16%，表明該降解菌株對(duì)濃度較高的阿特拉津的耐受性較弱。

圖5 阿特拉津初始濃度對(duì)降解的影響Fig 5 Effect of initial concentration on degradation rate

2.3 阿特拉津降解產(chǎn)物的測(cè)定

阿特拉津的降解產(chǎn)物用UPLC-MS進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明(圖6)，在培養(yǎng)液中檢測(cè)到了一種產(chǎn)物，離子大小為M-1=128.01(m/z)。參考相關(guān)文獻(xiàn)[25-26]，通過(guò)阿特拉津的降解途徑結(jié)合其分子量大小可以推測(cè)出該產(chǎn)物為氰尿酸。隨后繼續(xù)增加培養(yǎng)時(shí)間并未檢測(cè)到新物質(zhì)的出現(xiàn)，說(shuō)明該降解菌株只能將阿特拉津最終降解為氰尿酸，不能使其進(jìn)一步發(fā)生開(kāi)環(huán)反應(yīng)甚至完全礦化。另外，在已設(shè)定的MS操作條件下，未能在培養(yǎng)液中檢測(cè)到降解過(guò)程的中間產(chǎn)物，推測(cè)其可能在生成的同時(shí)被快速降解，無(wú)法在培養(yǎng)液中進(jìn)行大量累積，檢測(cè)時(shí)間一旦延后就無(wú)法檢測(cè)到它的存在。

圖6 降解產(chǎn)物的質(zhì)譜圖

Fig 6 The mass spectrogram of cyanuric acid

3 結(jié)論

阿特拉津作為一種分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的三嗪類(lèi)農(nóng)藥，其生物降解一直受到環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域的關(guān)注。與國(guó)內(nèi)外主要從土壤或活性污泥中篩選阿特拉津降解菌株的研究不同，本研究利用廣西特色農(nóng)作物甘蔗從其根部組織內(nèi)篩選到一株以阿特拉津?yàn)槲ㄒ坏瓷L(zhǎng)的降解菌株N-2，根據(jù)其形態(tài)特征及18S rRNA和ITS基因序列比對(duì)分析，將其初步鑒定為藤倉(cāng)鐮孢霉菌(F.fujikuroi)，該菌種對(duì)阿特拉津的降解尚未見(jiàn)報(bào)道，為新型降解菌株。研究考察了該菌株降解阿特拉津的最佳條件，測(cè)定了阿特拉津的降解產(chǎn)物，為今后對(duì)菌株特性進(jìn)行更深入的研究和利用基因工程手段進(jìn)行相應(yīng)生物降解工作提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

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The study of atrazine degraded by endophytic fungus from sugarcane

ZHANG Jia-li1，2, WANG Yan-hui3, DU Liang-wei1，2

(1. State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, Guangxi University,Nanning 530004； 2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning 530004;3. Plant Protection Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007, China)

An endophytic fungus strain of degrading atrazine was isolated from the roots of sugarcane in Guangxi farmland which has been sprayed by atrazine for a long time. It was preliminarily identified asFusariumfujikuroiaccording to its morphological characteristics and the analysis of its 18S rRNA and ITS gene sequences. The degradation characteristics were also investigated. The results showed that the strain could use atrazine as sole nitrogen source and had the best degradation property under those conditions: pH 7-8, temperature 28℃, atrazine primary concentration 25 mg/L. The degradation rate could reach 49.6% after 10 days. The degradation products were determined by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS). The results showed that the degradation product was cyanuric acid.

atrazine； biodegradation； endophyte； degrading characteristics

2016-04-07；

2016-04-14

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31660524，31460479)

張佳麗，碩士，研究方向?yàn)榄h(huán)境與生物分析化學(xué)，E-mail:tcdgaga@live.cn

杜良偉，博士，副教授，研究方向?yàn)榄h(huán)境與生物化學(xué)分析，E-mail:dulily6@163.com

X172;X592

A

2095-1736(2017)01-0030-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.01.030