岳改英李 景解欣然周旭升李江敏子谷玉紅易京紅

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；2.北京市房山區(qū)韓村河鎮(zhèn)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，北京 102423；3.北京市中醫(yī)研究所，北京 100010）

·研究報告·

基于ROCK-MAPK通路觀察糖心寧干預(yù)糖尿病心肌病作用機(jī)制研究*

岳改英1，2李 景1△解欣然3周旭升1李江敏子1谷玉紅1易京紅1△

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；2.北京市房山區(qū)韓村河鎮(zhèn)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，北京 102423；3.北京市中醫(yī)研究所，北京 100010）

目的 觀察糖心寧對糖尿病心肌病大鼠心肌組織ROCK、JNK及P38MAPK蛋白表達(dá)的影響，探討其對ROCK-MAPK信號通路的作用機(jī)制。方法 采用鏈脲佐菌素制備糖尿病心肌病大鼠模型，40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、法舒地爾組、糖心寧高劑量組、糖心寧等效劑量組各8只?？瞻捉M及模型組灌服等量清潔飲用水，法舒地爾組給予法舒地爾腹腔注射，糖心寧組灌服中藥糖心寧。給藥8周后處死大鼠，計算左心室肥厚指數(shù)，檢測血糖、血脂水平；HE染色觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；免疫組化法檢測心肌組織ROCK、JNK、P38MAPK蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 給藥8周末，模型組大鼠空腹血糖、甘油三酯明顯高于空白組（均P＜0.05）；與模型組比較，法舒地爾組、糖心寧高劑量組、糖心寧等效劑量組甘油三酯水平明顯降低（均P＜0.05），但空腹血糖未見明顯變化（均P＞0.05）。模型組大鼠心肌肥厚指數(shù)明顯高于空白組（P＜0.05）；與模型組比較，法舒地爾組、糖心寧高劑量組、糖心寧等效劑量組心肌肥厚指數(shù)均低于模型組（P＜0.05）。HE染色光鏡下觀察，空白組大鼠心肌細(xì)胞肌節(jié)完整，肌絲、線粒體排列比較整齊。模型組大鼠心肌細(xì)胞腫脹，肌絲排列稀疏，肌絲斷裂、溶解，心肌出現(xiàn)大面積玻璃樣變性及壞死。糖心寧高劑量組、糖心寧等效劑量組、法舒地爾組大鼠心肌細(xì)胞腫脹，肌絲排列均較模型組有明顯好轉(zhuǎn)。與空白組大鼠比較，模型組大鼠的ROCK1蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05），而ROCK2蛋白表達(dá)未見明顯增加（P＞0.05）。與模型組大鼠比較，法舒地爾組、糖心寧高劑量組、糖心寧等效劑量組的ROCK1蛋白表達(dá)受到顯著抑制 （P＜0.05），ROCK2蛋白表達(dá)未見明顯改變 （P＞0.05）。與法舒地爾組比較，糖心寧高劑量組明顯抑制ROCK1蛋白表達(dá)（P＜0.05），而糖心寧等效劑量組則并不明顯（P＞0.05）。與空白組大鼠比較，模型組大鼠的JNK、P38MAPK蛋白表達(dá)均顯著增加（P＜0.05），與模型組大鼠比較，法舒地爾組、糖心寧高、等效劑量組大鼠JNK、P38MAPK蛋白表達(dá)均明顯受到抑制（P＜0.05）。結(jié)論 糖心寧能減輕糖尿病心肌病大鼠的心室重構(gòu)，其機(jī)制可能與抑制ROCK-MAPK信號通路有關(guān)。

糖尿病心肌病 心室重構(gòu) 糖心寧 ROCK-MAPK信號通路

糖尿病心肌?。―CM）是糖尿病狀態(tài)下排除其他引起心臟異常的因素后，出現(xiàn)的一系列心臟結(jié)構(gòu)異常，并最終導(dǎo)致心肌重構(gòu)的病理改變［1］，是一種獨(dú)特的心肌病理狀態(tài)，心肌肥大、心肌灶性壞死、廣泛纖維化和心肌內(nèi)小動脈內(nèi)膜及內(nèi)膜下增厚是糖尿病心肌病的特征性病理表現(xiàn)［2］，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為多個信號傳導(dǎo)通路參與了心室重構(gòu)過程，目前認(rèn)識到的介導(dǎo)心室重構(gòu)的信號通路主要包括蛋白激酶 C（PKC）通路、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN）通路和絲裂素活化蛋白激酶（MAPK）通路等。本實(shí)驗通過給予ROCK通路阻滯劑法舒地爾作為對照藥，探討糖心寧對ROCK-MAPK信號通路的影響及其減輕心室重構(gòu)的作用機(jī)制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性SD大鼠44只，SPF級，體質(zhì)量180～220 g，于SPF級動物房喂養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為恒溫20～24℃，相對濕度40～70℃，明暗交替12 h/12 h，普通飼料，自由進(jìn)食水。由中國食品藥品檢定研究院提供，動物合格證號：SCXK（京）2014-0013。

1.2 試藥與儀器 糖心寧（太子參、麥冬、五味子、丹參、川芎、香附、香櫞、佛手、牡丹皮、赤芍、黃連），由北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供。糖心寧制備成水煎劑，等效劑量為成人正常劑量按體表面積系數(shù)折算乘以7，高劑量為等效劑量的2倍。鹽酸法舒地爾注射液（依立盧，旭化成制藥株式會社，批準(zhǔn)文號：H20100282）。鏈脲佐菌素（STZ，貨號：S0130，Sigma生產(chǎn)）、兔抗大鼠MMP-2單克隆抗體（貨號：BA0569，武漢博士德生物公司生產(chǎn)）、兔抗大鼠 MMP-9單克隆抗體（貨號：PB0710，武漢博士德生物公司生產(chǎn)）、兔抗大鼠TIMP-1多克隆抗體（貨號：BA0575，武漢博士德生物公司生產(chǎn)）、兔抗大鼠TIMP-2多克隆抗體等（貨號：BA0576，武漢博士德生物公司生產(chǎn)）、脫水機(jī)、包埋機(jī) （Leica公司提供，EG1140C）、石蠟切片機(jī)（Leica公司提供，RM2135），生物圖像分析軟件AON-STUDIO 2012等。

1.3 造模與給藥 采用鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射制作糖尿病大鼠模型［3-4］。普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食12 h，期間自由飲水，造模組35只大鼠按55 mg/kg劑量單次腹腔內(nèi)注射STZ，空白組9只大鼠腹腔內(nèi)注射等體積檸檬酸緩沖液，分別于72 h、1周后，采用葡萄糖氧化酶法尾靜脈取血測定空腹血糖，兩次空腹血糖均≥11.1 mmol/L，定義為糖尿病大鼠造模成功。第5周（STZ注射后第4周），空白組隨機(jī)抽取1只大鼠、造模組隨機(jī)抽取3只大鼠取材，HE染色，觀察空白組及造模組的心肌組織，若造模組表現(xiàn)為心肌細(xì)胞腫脹，肌絲排列稀疏，肌絲斷裂、溶解，心肌出現(xiàn)大面積玻璃樣變性及壞死，可認(rèn)為DCM大鼠造模成功。空白組大鼠8只，模型組大鼠32只，將模型組隨機(jī)分為4組，分別為模型組、法舒地爾組、糖心寧高劑量組、糖心寧等效劑量組?？瞻捉M、模型組予等量清潔飲用水灌胃，每日1次，按1 mL/100 g計算，法舒地爾組給予法舒地爾10 mg/（kg·d）腹腔注射，糖心寧高劑量組給予糖心寧9 g/（kg·d）灌胃，等效劑量組給予4.5 g/（kg·d）灌胃，每日1次，共給藥8周。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 1）一般情況：平時記錄大鼠活動狀態(tài)、毛色、精神狀態(tài)、飲食、二便情況。每周測血糖和稱體質(zhì)量。2）心肌肥厚指數(shù)（LVHI）：給藥8周結(jié)束后，腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）將大鼠麻醉，腹主動脈取血，3000 r/min離心15 min，分離血清，處死動物，迅速取出心臟，稱取動物全心質(zhì)量（CW）、左心室游離壁濕質(zhì)量（LVW），計算LVHI，LVHI=LVW/CW。心臟保存于10%甲醛溶液。3）心肌組織形態(tài)學(xué)觀察：HE染色光鏡下觀察大鼠心肌細(xì)胞腫脹程度，肌絲、肌纖維排列情況。4）免疫組化法檢測心肌組織ROCK、JNK、P38MAPK蛋白表達(dá)：采用免疫組化方法石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，過梯度酒精，PBS清洗后甩干，內(nèi)源性過氧化物酶封閉消除背景染色，PBS清洗，浸入檸檬酸鹽溶液，水浴鍋加熱法修復(fù)抗原，冷卻至常溫，正常山羊血清封閉非特異性抗原，PBS清洗甩干，滴加一抗小鼠一抗，4℃過夜。PBS泡洗、甩干，加入羊抗小鼠二抗，PBS洗片，DAB顯色，封片，在400倍鏡下拍片，每張片選10個視野。應(yīng)用生物圖像分析軟件 AON-STUDIO 2012對ROCK、JNK、P38MAPK（細(xì)胞質(zhì)中棕褐色顆粒為陽性）表達(dá)進(jìn)行圖像分析，測量陽性物質(zhì)的面積百分比（Percent）和積分光密度（IOD），結(jié)果用質(zhì)量評分公式Q=P/I（Q：Quality，P：Percent陽性物質(zhì)表達(dá)面積，I：IOD值）來評價蛋白表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用Sigmastat 4.0軟件。進(jìn)行方差分析，各組間兩兩差異比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血糖、血脂水平比較 見表1。結(jié)果顯示，模型組大鼠空腹血糖、甘油三酯明顯高于空白組（均P＜0.05）；與模型組比較，法舒地爾組、糖心寧高劑量組、糖心寧等效劑量組甘油三酯水平明顯降低（均P＜0.05），但空腹血糖未見明顯變化（均P＞0.05）。

表1 各組大鼠血糖、血脂水平比較（）

表1 各組大鼠血糖、血脂水平比較（）

與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組 別 n 血糖（mmol/L） 甘油三酯（mmol/L）空白組 8 5.68±0.53 1.73±0.69模型組 8 24.77±3.22*11.29±6.31*法舒地爾組 8 25.69±2.92 4.01±2.06△糖心寧高劑量組 8 26.18±5.03 5.38±3.29△糖心寧等效劑量組 8 25.20±4.76 2.18±1.43△

2.2 各組大鼠LVHI比較 見表2。模型組大鼠LVHI明顯高于空白組（P＜0.05）；與模型組比較，法舒地爾組、糖心寧高劑量組、糖心寧等效劑量組心肌肥厚指數(shù)均低于模型組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠LVHI比較（）

表2 各組大鼠LVHI比較（）

組別 n CW（g）空白組 8 1.28±0.19模型組 8 1.77±0.18法舒地爾組 8 0.99±0.08糖心寧高劑量組 8 1.03±0.18糖心寧等效劑量組 8 1.08±0.19 LVW（g） LVHI 0.93±0.12 0.64±0.02 1.13±0.09 0.73±0.08*0.65±0.09 0.65±0.06△0.67±0.09 0.64±0.06△0.69±0.12 0.65±0.06△

2.3 各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化比較 見圖1。HE染色光鏡下觀察，空白組大鼠心肌細(xì)胞肌節(jié)完整，肌絲、線粒體排列比較整齊。模型組大鼠心肌細(xì)胞腫脹，肌絲排列稀疏，肌絲斷裂、溶解，心肌出現(xiàn)大面積玻璃樣變性及壞死。糖心寧高劑量組、糖心寧等效劑量組、法舒地爾組大鼠心肌細(xì)胞腫脹，肌絲排列均較模型組有明顯好轉(zhuǎn)。

圖1 各組糖尿病心肌病大鼠心肌組織（HE染色，200倍）

2.4 各組大鼠心肌組織ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)比較 見表3。與空白組大鼠比較，模型組大鼠的ROCK1蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05），而ROCK2蛋白表達(dá)未見明顯增加（P＞0.05）。與模型組大鼠比較，法舒地爾組、糖心寧高劑量組、糖心寧等效劑量組的ROCK1蛋白表達(dá)受到顯著抑制 （P＜0.05），ROCK2蛋白表達(dá)未見明顯改變（P＞0.05）。與法舒地爾組比較，糖心寧高劑量組明顯抑制ROCK1蛋白表達(dá)（P＜0.05），而糖心寧等效劑量組則并不明顯（P＞0.05）。

表3 各組大鼠ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)比較（）

表3 各組大鼠ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)比較（）

與法舒地爾組比較，#P＜0.05。

組別 n ROCK1 ROCK2空白組 8 146.17±10.54 50.99±10.79模型組 8 187.21±8.87*64.51±11.74法舒地爾組 8 89.14±11.00△61.61±6.78糖心寧高劑量組 8 96.62±14.28△#57.28±10.79糖心寧等效劑量組 8 102.13±8.54△56.97±7.01

2.5 各組大鼠心肌組織JNK、P38MAPK蛋白表達(dá)比較 見表4。與空白組大鼠比較，模型組大鼠的JNK、P38MAPK蛋白表達(dá)均顯著增加（P＜0.05），與模型組大鼠比較，法舒地爾組、糖心寧高、等效劑量組大鼠JNK、P38MAPK蛋白表達(dá)均明顯受到抑制（P＜0.05）。

表4 各組大鼠JNK、P38MAPK蛋白表達(dá)比較（）

表4 各組大鼠JNK、P38MAPK蛋白表達(dá)比較（）

組別 n JNK P38MAPK空白組 8 62.88±14.87 64.99±11.42模型組 8 157.19±22.25*117.82±12.70*法舒地爾組 8 129.36±17.10△45.56±7.99△糖心寧高劑量組 8 95.91±13.94△51.63±10.21△糖心寧等效劑量組 8 126.60±14.23△52.94±7.44△

3 討 論

心室重構(gòu)是心臟對損傷、負(fù)荷、神經(jīng)體液激素等病理性刺激的代償性、適應(yīng)性變化，但是長期的病理性刺激會導(dǎo)致適應(yīng)不良，產(chǎn)生心肌肥大、心肌細(xì)胞凋亡及間質(zhì)纖維化等結(jié)構(gòu)性改變，使心肌相對缺血、缺氧，進(jìn)而發(fā)展成為心力衰竭，是糖尿病心肌病的特征性病理表現(xiàn)。

Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶（ROCK）信號通路是機(jī)體各組織中普遍存在的一條信號傳導(dǎo)通路，ROCK與其下游效應(yīng)分子是細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路的重要成分。目前多種心室重構(gòu)動物模型中均發(fā)現(xiàn)ROCK通路的活化，包括壓力負(fù)荷、損傷、激素（AngⅡ、醛固酮及異丙腎上腺素等）及糖尿病誘導(dǎo)的大鼠模型［5-9］。ROCK主要包括兩種亞型：ROCK1和ROCK2。ROCK1定位于第18號染色體，包含1354個氨基酸。ROCK2定位于第2號染色體，包含1388個氨基酸。兩者具有65%的氨基酸同源性和92%的催化結(jié)構(gòu)域同源性。有研究顯示ROCK在糖尿病心肌病的心肌重構(gòu)中發(fā)揮了作用，心臟局限的ROCK1高表達(dá)能促使心肌纖維化和細(xì)胞凋亡，加速心室重構(gòu)成為心力衰竭［10-11］，而ROCK1基因剔除能抑制心肌纖維化和細(xì)胞凋亡，完全防止小鼠死亡，并阻止心室重構(gòu)進(jìn)展成為心力衰竭［10］。而ROCK2［12］能抑制心肌肌鈣蛋白T/I，故ROCK2可能參與調(diào)解細(xì)胞的收縮功能。

MAPK是一組能被不同的細(xì)胞外刺激，如細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細(xì)胞應(yīng)激及細(xì)胞粘附等激活的有絲分裂原活化蛋白激酶，主要包括3個亞族：ERK、JNK、p38MAPK。Zhang L等［13］研究發(fā)現(xiàn)抑制P38MAPK磷酸化后可減少心肌纖維化，減輕心室重構(gòu)。Li CJ等［14］研究表明通過抑制JNK和P38MAPK的激活后可減輕DCM大鼠的心室重構(gòu)。MAPK作為ROCK的下游通道，通過抑制ROCK通路，進(jìn)而使MAPK通路的JNK、P38MAPK等蛋白表達(dá)受到抑制，能夠減輕DCM大鼠的心肌重構(gòu)。Fierro C等［15］研究也發(fā)現(xiàn)，在左心室和主動脈壁中法舒地爾能降低MYPT-1、ERM及P38MAPK的磷酸化水平。本實(shí)驗中法舒地爾組通過抑制ROCK進(jìn)而抑制JNK、P38MAPK蛋白表達(dá)，進(jìn)而減輕心室重構(gòu)，與既往研究也是基本一致的。同時本實(shí)驗研究顯示DCM大鼠ROCK1蛋白表達(dá)顯著增加，ROCK2蛋白表達(dá)未見明顯變化，說明主要通過激活DCM大鼠的ROCK1進(jìn)而激活了ROCK-MAPK通路參與了心室重構(gòu)。

糖心寧是我院國家級名老中醫(yī)魏執(zhí)真教授多年臨床實(shí)踐形成的經(jīng)驗方劑。方以太子參、麥冬、五味子益氣養(yǎng)心，以香附、香櫞、佛手寬胸理氣，配以丹參、川芎活血通脈，牡丹皮、赤芍涼血清熱，黃連厚腸止瀉，諸藥相伍，共奏益氣養(yǎng)心、理氣通脈、涼血清熱之功。既往實(shí)驗研究結(jié)果［16］顯示，糖心寧能夠改善實(shí)驗性DCM大鼠的心肌、微血管和冠狀動脈病變；對DCM心肌超微結(jié)構(gòu)變化病理改變具有明顯改善作用，從而起到對心臟的保護(hù)作用，延緩心室重構(gòu)。本實(shí)驗中，與法舒地爾組比較，糖心寧高劑量組、等效劑量組也通過抑制ROCK進(jìn)而抑制JNK、P38MAPK蛋白表達(dá)，說明糖心寧可能通過與法舒地爾相同的機(jī)制即抑制ROCKMAPK從而減輕DCM的心室重構(gòu)。

綜上所述，本實(shí)驗研究通過給予ROCK通路阻滯劑法舒地爾作為對照藥，研究糖心寧減輕糖尿病心肌病大鼠心室重構(gòu)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，初步發(fā)現(xiàn)糖心寧高劑量組、等效劑量組抑制ROCK1、JNK、P38MAPK蛋白表達(dá)與法舒地爾組基本一致，其改善實(shí)驗性糖尿病心臟病大鼠心肌病變，延緩心室重構(gòu)可能是通過ROCKMAPK信號通路實(shí)現(xiàn)。實(shí)驗設(shè)計針對ROCK-MAPK通路中MAPK3個亞族中的JNK、P38MAPK進(jìn)行了研究，但對ERK這一支通路尚未涉及；研究中還發(fā)現(xiàn)ROCK2蛋白表達(dá)未見明顯變化，其在DCM大鼠心室重構(gòu)中的作用有待進(jìn)一步探討。

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Mechanism Research on the Effect of Tangxinning on Diabetic Cardiomyopathy Based on ROCK-MAPK Signal Pathway

YUE Gaiying，LI Jing，XIE Xinran，et al.
Affiliated Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine of Capital Medical University，Beijing 100010，China.

Objective：To observe the effect of Tangxinning on the expression of ROCK，JNK and P38MAPK protein in myocardium of diabetic rats with cardiomyopathy，and to explore its mechanism of ROCK-MAPK signal pathway.Methods：Diabetic cardiomyopathy rats were induced by streptozotocin.The rats were randomly divided into blank group，model group，fasudil group，Tangxinning high dose group and Tangxinning equivalent dose group with 8 cases in each group.The blank control group and the model group were given the same amount of clean drinking water.The fasudil group was given intraperitoneal injection of fasudil，the Tangxinning group was given Chinese medicine Tangxinning.After 8 weeks，the rats were sacrificed and the left ventricular hypertrophy index was calculated and the levels of blood glucose and lipid were measured.The morphological changes of myocardium were observed by HE staining.The expression of ROCK，JNK and P38MAPK protein in myocardium was detected by immunohistochemistry.Results：Compared with the model group，the left ventricular hypertrophy wassignificantly decreased in the fasudil group，the Tangxinning high-dose group and the Tangxinning equivalentdose group（P＜0.05）.The improvement on the swelling of the cardiomyocytes was significant（P＜0.05），and the expression of ROCK1，JNK and P38MAPK was decreased significantly，but no significant changes in ROCK2 protein expression.Conclusion：Tangxinning can reduce the ventricular remodeling in rats with diabetic cardiomyopathy，and its mechanism may be related to inhibition of ROCK-MAPK signaling pathway.

Diabetic cardiomyopathy；Ventricular remodeling；Tangxinning；ROCK-MAPK signal pathway

R285.5

A

1004-745X（2017）01-0026-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.01.008

2016-10-13）

首都中醫(yī)藥研究專項一般項目（15ZY15）；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院“育苗計劃”院級課題（2014YM-07）

△通信作者（電子郵箱：kycyjh@sina.com）