宋佳麗，楊琳，亢君君，李昊庭，董秀珍，付峰

1.第四軍醫(yī)大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程系，西安 陜西 710032；2.第四軍醫(yī)大學(xué) 基礎(chǔ)部，西安 陜西 710032

在體測(cè)量大鼠缺血性腦損傷引起的腦組織電阻抗變化及組織形態(tài)學(xué)對(duì)照研究

宋佳麗1，楊琳1，亢君君2，李昊庭1，董秀珍1，付峰1

1.第四軍醫(yī)大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程系，西安 陜西 710032；2.第四軍醫(yī)大學(xué) 基礎(chǔ)部，西安 陜西 710032

目的用電阻抗的變化趨勢(shì)區(qū)分缺血腦卒中及其繼發(fā)性腦水腫。方法 采用兩電極法連續(xù)在體測(cè)量腦缺血大鼠腦組織的電阻抗，觀察分析卒中后腦組織電阻抗隨時(shí)間的變化規(guī)律，并用Image-Pro Plus分析微觀形態(tài)學(xué)參數(shù)，作為腦卒中后電阻抗變化的對(duì)照和驗(yàn)證。結(jié)果大鼠腦組織在缺血6～8 h后，電阻抗達(dá)到峰值，與正常腦組織的電阻抗相比高10%～20%，隨后大鼠缺血腦組織的電阻抗降低，同時(shí)缺血腦組織電阻抗的變化與微觀形態(tài)學(xué)參數(shù)的變化有良好的相關(guān)性。結(jié)論大鼠缺血腦組織電阻抗隨大鼠腦缺血時(shí)間的變化趨勢(shì)表明，生物電阻抗測(cè)量技術(shù)有望用于區(qū)分缺血性腦卒中和卒中后的腦水腫。

心腦血管疾??；缺血性腦卒中；腦水腫；生物電阻抗測(cè)量；微觀形態(tài)學(xué)分析

引言

中國(guó)作為全世界腦卒中致死致殘率最高的國(guó)家，每年有250萬(wàn)新發(fā)腦卒中患者，有140萬(wàn)人死于腦卒中[1-2]。腦卒中分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中占75%～90%[3]。腦卒中會(huì)引起繼發(fā)性腦水腫，腦卒中和腦水腫的治療方案不同，因此這兩種腦損傷的診斷和區(qū)分、腦卒中的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)極為重要?，F(xiàn)有的X-CT和MRI技術(shù)無(wú)法診斷早期的缺血性腦卒中、區(qū)分缺血性腦卒中和腦水腫、監(jiān)測(cè)腦卒中。因此，臨床上急需診斷監(jiān)測(cè)腦卒中的新技術(shù)。

生物電阻抗測(cè)量技術(shù)是一種新型測(cè)量技術(shù)，早在1926 年Fricke H和 Morse S就提出將電阻抗測(cè)量技術(shù)用于乳腺癌的檢測(cè)[4]，由于生物電阻抗測(cè)量技術(shù)具有無(wú)創(chuàng)、無(wú)輻射、廉價(jià)等優(yōu)勢(shì)[5]，這些優(yōu)勢(shì)吸引很多學(xué)者探索了生物電阻抗測(cè)量技術(shù)檢測(cè)診斷顱腦損傷[6-8]、宮頸癌[9]、膀胱癌[10]、肺功能障礙[11]等疾病的途徑。我們研究小組致力于研究生物電阻抗測(cè)量技術(shù)在顱腦損傷監(jiān)測(cè)方面的應(yīng)用，同時(shí)還有很多國(guó)內(nèi)外研究小組致力于此方向的研究。

1972年，F(xiàn)ujita等將貓腦冷凍引起腦水腫，采用四電極法在體測(cè)量腦部電阻抗，腦損傷組織的阻抗值與正常腦相比下降了25%[12]。2002年，Lingwood等報(bào)道稱(chēng)缺氧引起小豬腦損傷后的6 h內(nèi)腦部電阻抗增加，并證明電阻抗測(cè)量技術(shù)對(duì)腦水腫的敏感性比顱內(nèi)壓監(jiān)測(cè)技術(shù)高[13]。2008年，Harting等在體測(cè)量外傷性腦損傷大鼠的腦組織的阻抗值，發(fā)現(xiàn)外部撞擊損傷60 h后的大鼠的損傷腦組織相比于正常腦組織有明顯的下降[14]。2013年，達(dá)特摩斯大學(xué)的Manwaring等在家豬的腦白質(zhì)中注入新鮮血液，測(cè)得注血后的腦組織的電導(dǎo)率升高（19.5±11.5）mS/m[15]。2015年，Holder研究小組分別用兩電極法和四電極法在體測(cè)量大鼠的正常腦組織和缺血腦組織的電阻抗，離體測(cè)量血塊的電阻抗，發(fā)現(xiàn)在0～3 kHz的頻率范圍，缺血腦組織的阻抗值高于正常腦組織阻抗值[16]。這些研究明確地表明腦損傷的生物物理學(xué)變化會(huì)引起腦組織生物電阻抗的變化，因此，生物電阻抗測(cè)量技術(shù)有望成為診斷監(jiān)測(cè)腦損傷的新技術(shù)。然而，不同研究小組模型制備方法不同，導(dǎo)致腦損傷的種類(lèi)不同，其后形成繼發(fā)性腦水腫的生物物理學(xué)機(jī)制也不同；再者，不同研究小組測(cè)量的時(shí)間點(diǎn)也不同，測(cè)得的電阻抗的變化規(guī)律都是腦損傷某個(gè)階段的電阻抗的變化規(guī)律，由于從初期的腦損傷到其后的繼發(fā)性腦水腫，腦組織的生物物理變化并不相同，宏觀上自然表現(xiàn)出電阻抗變化的不同。這些不同導(dǎo)致目前研究結(jié)果的不一致，使生物阻抗測(cè)量技術(shù)距離顱腦疾病的臨床監(jiān)測(cè)還有一定差距，因此，探究腦損傷發(fā)展過(guò)程中電阻抗的變化趨勢(shì)是生物電阻抗技術(shù)應(yīng)用于顱腦損傷臨床監(jiān)測(cè)的必經(jīng)之路。本研究試圖利用腦組織在不同狀態(tài)下阻抗值不同的特性，用生物電阻抗技術(shù)來(lái)診斷、區(qū)分缺血性腦卒中和腦水腫。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)方案

1.1.1 動(dòng)物準(zhǔn)備

從第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心領(lǐng)取體重為250～300 g的雄性大鼠22只，飼養(yǎng)溫度為23～25°C，飼養(yǎng)時(shí)不控制大鼠的飲食。實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵守動(dòng)物倫理委員會(huì)的管理?xiàng)l例，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭苽?/p>

大鼠用10%水合氯醛（3.5 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥固定，頸正中線偏右1 mm切口1.5～2 cm，沿胸鎖乳突肌方向分離右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），結(jié)扎CCA和ECA的近心端，在ICA近心端繞細(xì)線備用。在距離CCA分叉口1～2 mm處剪一個(gè)小口，將拴線插入到ICA中，插入深度為18 mm，梗阻右腦中動(dòng)脈，然后用之前繞在ICA近心端的細(xì)線扎緊系牢，最后縫合傷口。

1.1.3 腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ万?yàn)證、腦缺血體積及腦水腫程度測(cè)定從領(lǐng)取的22只大鼠中隨機(jī)選取4只梗阻中動(dòng)脈，分別在手術(shù)后2、6、10和12 h處死，取出新鮮腦組織，將其置于-20°C冰箱10 min后取出，在腦槽中切成約2 mm

厚的均勻腦組織切片。腦片放入1%TTC溶液中染色，在

37°C溫箱中孵育20～30 min，缺血腦組織被染成白色，正常腦組織被染成紅色。用高清照相機(jī)拍照，并用Image-Pro Plus軟件計(jì)算缺血體積及腦水腫程度。參照文獻(xiàn)[17-18]的計(jì)算公式：

其中，VIS為腦缺血體積，VIN為腦梗死體積，VL為左半腦的體積，VR為右半腦的體積，EBE為腦水腫的程度。1.1.4 電阻抗值的測(cè)量

從領(lǐng)取的大鼠中隨機(jī)選取10只，其中7只梗阻右腦中動(dòng)脈，并在大鼠右腦上方的顱骨打兩個(gè)直徑1 mm的小孔，不破壞硬腦膜，插入牙科釘并固定，將以Solartron1260電阻抗分析儀和1294生物電阻抗測(cè)量接口為核心的電阻抗頻譜測(cè)量平臺(tái)與牙科釘連接，采用兩電極法連續(xù)測(cè)量大鼠右腦電阻抗12 h，測(cè)量頻率為50 kHz，毎分鐘一個(gè)點(diǎn)，作為實(shí)驗(yàn)組。其余3只大鼠麻醉后，不進(jìn)行中動(dòng)脈梗阻，直接在大鼠右腦上方顱骨打孔并以上述方法連續(xù)測(cè)量右腦電阻抗，作為對(duì)照組。

1.1.5 組織形態(tài)學(xué)對(duì)照

領(lǐng)取的大鼠中最后8只大鼠，將其中7只大鼠的右腦中動(dòng)脈梗阻，分別在1、2、4、6、8、10和12 h后處死并灌注，然后取左右腦組織樣本經(jīng)石蠟包埋、切片（2～4 μm）、HE染色，在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察分析，并使用Image-Pro Plus軟件提取微觀形態(tài)學(xué)參數(shù)。剩下的1只大鼠不做任何處理，直接處死灌注，并用上述方法觀察分析。

1.2 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）的形式表示，用SPSS 14.0處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物模型驗(yàn)證結(jié)果

TTC染色結(jié)果，見(jiàn)圖1，圖中被染成紅色的腦組織為正常腦組織，白色腦組織為缺血腦組織。因此，本研究使用的模型制作方法成功的使大鼠的右腦形成了局部缺血。

將圖1中的各個(gè)圖片分別用Image-Pro Plus軟件處理，計(jì)算得到的缺血腦組織的體積分別為25.91%、15.54%、22.05%和53.76%。軟件計(jì)算的腦水腫的程度如下：模型建立2、4、6和12 h后的缺血腦組織的體積，腦水腫的程度分別為6.39%、6.82%、8.49%和22.30%。

圖1 大鼠腦缺血不同時(shí)段TTC染色結(jié)果

2.2 電阻抗測(cè)量結(jié)果

測(cè)得的對(duì)照組3只大鼠的腦阻抗值，見(jiàn)圖2，阻抗值都沒(méi)有明顯變化，阻抗值變化不超過(guò)5%。

圖2 大鼠正常腦組織阻抗值隨時(shí)間的變化

在體測(cè)得的實(shí)驗(yàn)組7只大鼠的腦阻抗值隨時(shí)間的變化規(guī)律，見(jiàn)圖3。圖3顯示了缺血腦組織的阻抗值先升高后降低，并在腦缺血6～8 h腦組織的阻抗值達(dá)到峰值，此時(shí)組織電阻抗相對(duì)于腦梗初期升高10%～15%。

圖3 大鼠缺血腦組織阻抗值隨時(shí)間的變化

2.3 微觀形態(tài)對(duì)照結(jié)果

在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖4，在中動(dòng)脈梗阻2 h后，缺血缺氧造成神經(jīng)細(xì)胞嗜酸性增強(qiáng)，同時(shí)水在細(xì)胞內(nèi)的潴留導(dǎo)致細(xì)胞體積膨大；中動(dòng)脈梗阻6 h后，血管內(nèi)皮細(xì)胞與腦實(shí)質(zhì)之間間隙增大，腦細(xì)胞染色質(zhì)固縮，而且腦實(shí)質(zhì)中水分增加；10 h后，血管的管腔閉塞，小膠質(zhì)細(xì)胞逐漸增多，部分神經(jīng)細(xì)胞壞死。

圖4 大鼠缺血腦組織不同時(shí)段腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)結(jié)果

細(xì)胞核個(gè)數(shù)和細(xì)胞面積隨缺血時(shí)間的變化，見(jiàn)圖5，在缺血2 h時(shí)，大鼠腦組織細(xì)胞個(gè)數(shù)減少，同時(shí)細(xì)胞面積增大；在缺血6 h時(shí)，在單位視野內(nèi)大鼠腦組織細(xì)胞相對(duì)于缺血2 h的腦組織細(xì)胞個(gè)數(shù)幾乎不變而細(xì)胞的體積增大；動(dòng)物腦組織缺血10 h的細(xì)胞個(gè)數(shù)及細(xì)胞面積都有下降趨勢(shì)。

圖5 腦組織微觀形態(tài)學(xué)指標(biāo)：細(xì)胞核個(gè)數(shù)、細(xì)胞面積

3 討論

在本研究中，動(dòng)物模型的制作較成功，大鼠的右腦形成缺血區(qū)，并且腦水腫的程度也隨時(shí)間遞增。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血的12 h中大腦的電阻抗先升高后降低，在腦缺血6 h左右大腦的電阻抗達(dá)到峰值，比缺血初期高10%～15%。對(duì)照微觀形態(tài)學(xué)的分析結(jié)果，缺血性腦卒中占主導(dǎo)地位時(shí)，腦組織的電阻抗呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；腦繼發(fā)性腦水腫開(kāi)始占據(jù)主導(dǎo)地位是，腦組織的電阻抗開(kāi)始下降。

本研究在腦組織缺血6 h內(nèi)腦損傷組織的阻抗值升高，與Lingwood等報(bào)道的缺氧后的6 h內(nèi)腦組織的阻抗值持續(xù)升高一致[13]，但與達(dá)特摩斯大學(xué)的Manwaring等報(bào)道的在腦白質(zhì)中注入新鮮血液后腦組織電導(dǎo)率升高有所出入[14]，可能是損傷模型不同，導(dǎo)致?lián)p傷組織的電阻抗變化趨勢(shì)不同。D Holder研究小組動(dòng)物模型與本研究相似[16]，測(cè)得的損傷早期電阻抗值的變化趨勢(shì)也一致。

在本研究中，結(jié)果顯示缺血后的大鼠腦組織的電阻率在12 h內(nèi)呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)，這種變化趨勢(shì)的出現(xiàn)可能與缺血后腦組織的微觀形態(tài)的變化有關(guān)。腦缺血初期損傷組織的電阻抗的升高，可能與腦組織中血流量的減少以及細(xì)胞體積的膨大有關(guān)，細(xì)胞的膨大導(dǎo)致細(xì)胞間隙的減小，使組織電阻抗升高[19]；當(dāng)腦損傷進(jìn)一步加重時(shí)，細(xì)胞外液中的水分雖然增加，但同時(shí)細(xì)胞間隙也在擴(kuò)大，細(xì)胞間隙的增大使得在相同激勵(lì)下經(jīng)過(guò)組織的電流密度增大，導(dǎo)致組織電阻抗下降[19]。在腦損傷的發(fā)展過(guò)程中，當(dāng)細(xì)胞間隙的增大占據(jù)主導(dǎo)地位時(shí)，腦組織的電阻抗值就會(huì)出現(xiàn)下降趨勢(shì)；當(dāng)腦損傷發(fā)展為重度腦損傷時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞壞死或破裂，細(xì)胞膜通透性增加[20]，組織的電阻抗可能會(huì)進(jìn)一步下降。上述變化的示意圖，見(jiàn)圖6。腦缺血的前6 h，缺血性腦卒中占主導(dǎo)地位，腦組織的電阻抗呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；腦缺血8 h后，繼發(fā)性腦水腫開(kāi)始占據(jù)主導(dǎo)地位，導(dǎo)致腦組織電阻抗的下降。

圖6 腦組織缺血后微觀形態(tài)變化引起電阻抗變化的示意圖

本研究初步探索了缺血性腦損傷在發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腦組織電阻抗值變化的規(guī)律。如果能在此研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步延長(zhǎng)在體測(cè)量的時(shí)間，研究腦水腫發(fā)展過(guò)程中電阻抗的變化規(guī)律，可使研究更加完善。在本研究的基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步探索其他類(lèi)型的腦損傷（如出血性腦損傷）在發(fā)生發(fā)展過(guò)程中電阻抗值的變化規(guī)律，以及不同類(lèi)型腦損傷的電阻抗變化之間的區(qū)別。這些研究結(jié)果可以作為電阻抗斷層成像的基礎(chǔ)，來(lái)診斷不同類(lèi)型的腦損傷以及不同階段的腦損傷。

4 結(jié)論

本研究用生物電阻抗測(cè)量技術(shù)和組織微觀形態(tài)學(xué)對(duì)照的研究方法，證明了生物電阻抗測(cè)量技術(shù)可以用于區(qū)分缺血性腦卒中及其繼發(fā)性腦水腫。本研究小組計(jì)劃下一步研究出血性腦損傷的電阻抗變化規(guī)律，并通過(guò)電阻抗的變化區(qū)分缺血性腦損傷和出血性腦損傷。

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本文編輯 張丹妮

Electrical Impedance Variation Measurement of Rat Ischemic Brain Injuries and Tissue Morphology Control Study

SONG Jia-li1, YANG Lin1, KANG Jun-jun2, LI Hao-ting1, DONG Xiu-zhen1, FU Feng1
1. Faculty of Biomedical Engineering, Fourth Military Medial University, Xi’an Shaanxi 710032, China; 2. School of Basic Medical Sciences, Fourth Military Medial University, Xi’an Shaanxi 710032, China

ObjectiveTo study the impedance variation of ischemic stroke and its’ secondary brain edema to distinguish the two types of brain injuries. Methods Two-electrode method was used to measure impedance of rats’ brain in vivo continuously. Then we analyzed the impedance variation over time, and the microscopic morphology parameters were analyzed by Image-Pro Plus as comparison and verification of the impedance variation.ResultsElectrical impedance of rat ischemic brain has risen 10%～20% after 6～8 h of brain ischemia, where the peak of the electrical impedance shows out. Then the impedance reduced over time. And there was a good correlation between the impedance variation and the microscopic morphology parameters.ConclusionBioelectrical impedance measurement technique can be used to distinguish ischemic stroke and secondary brain edema, as indicated by the impedance variation of rat ischemic brain over time.

cardiac-cerebral vascular disease; ischemic stroke; brain edema; bioelectrical impedance measurement; microscopic morphology analysis

TM934.7；R743

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2017.01.005

1674-1633(2017)01-0018-04

2016-10-09

2016-11-09

國(guó)家自然科學(xué)基金（51477176）；軍隊(duì)重大項(xiàng)目（AW S14C006）。

付峰，教授，主要研究方向?yàn)轱B腦損傷的電阻抗成像研究。

通訊作者郵箱：fengfu@fmmu.edu.cn