張 勇，黃 鑫，李帥坪，劉淑瑩,2

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117；2.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所長春質(zhì)譜中心，吉林 長春 130022)

UPLC Orbitrap HRMS法分析西洋參蒸參棄液濃縮物中皂苷類成分

張 勇1，黃 鑫1，李帥坪1，劉淑瑩1,2

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117；2.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所長春質(zhì)譜中心，吉林 長春 130022)

采用超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC Orbitrap HRMS)技術(shù)測定西洋參蒸參棄液濃縮物中15種人參皂苷單體成分含量。采用Thermo Scientific Syncronis C18色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)，以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相，使用電噴霧電離源(ESI)，四極桿靜電場軌道阱質(zhì)量分析器，高分辨質(zhì)譜儀采集數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，人參皂苷Rg1、Rg2、Rg3、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rh1、Rh2、Rk1、Ro、F1、F2和偽人參皂苷F11在線性范圍內(nèi)均存在良好的線性關(guān)系，48 h內(nèi)穩(wěn)定性實驗RSD 值均小于5%，平均加樣回收率為94.38%～102.10%，RSD 值不大于3%。西洋鮮參在不同蒸制溫度和蒸制時間下得到9組蒸參棄液，通過分析其濃縮物中15種人參皂苷單體化合物的含量，并比較各成分含量的變化情況，總結(jié)了4種類型人參皂苷的化學(xué)轉(zhuǎn)化規(guī)律。該方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高、專屬性強、重復(fù)性好，適用于西洋參蒸參棄液濃縮物中皂苷成分含量的測定，可為開發(fā)蒸參棄液提供有效的檢測手段。

超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC Orbitrap HRMS)；西洋參蒸參棄液；人參皂苷

西洋參為五加科人參屬植物PanaxquinquefoliumL.的干燥根[1]，又名洋參、花旗參，原產(chǎn)于美國和加拿大[2]。目前我國市場上有兩種西洋參藥材產(chǎn)品：一種是進口產(chǎn)品，另一種是引進種植產(chǎn)品[3-4]。西洋參性寒涼、味微苦[5]，歸心、肺、腎經(jīng)[6]，具有補氣養(yǎng)陰、清熱生津的功效[7]，有增強免疫力[8]、提高記憶力[9]、降血糖[10-12]及降血壓[13]等藥理作用，因其治療和保健價值較高而被廣泛利用。西洋參蒸參棄液是西洋參在蒸制過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，俗稱蒸參水，是西洋參經(jīng)過水蒸氣的熏蒸、浸漬、冷卻后，產(chǎn)生的一種暗棕色、混濁的粘稠狀水溶液，其中含有人參皂苷、人參多糖以及多種氨基酸等[14-15]，在實際生產(chǎn)過程中一般將其作為廢液丟棄。季迪新等[16-17]采用紫外分光光度法測定了紅參蒸參水中人參皂苷的含量，但該方法靈敏度較低，專屬性較差。劉繼永等[18]采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)技術(shù)從紅參蒸參水中分離出24種醚溶性物質(zhì)，并對其中10 種化合物進行定性鑒定，同時采用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-ESI-MS) 技術(shù)對紅參蒸參水濃縮物中的12種人參單體皂苷進行了定性測定[19]。但是，尚未見采用超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC Orbitrap HRMS)法定量分析西洋參蒸參棄液濃縮物中的人參皂苷單體的報道。

本研究擬采用UPLC Orbitrap HRMS法測定西洋鮮參在不同蒸制溫度和蒸制時間得到的蒸參棄液濃縮物中15種人參皂苷單體含量，希望為蒸參棄液中人參皂苷的含量測定提供簡便快速、科學(xué)準(zhǔn)確的測定方法，并為蒸參棄液的充分利用提供重要依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

UltiMate 3000 series 高效液相色譜儀，Q-Exactive電噴霧軌道阱高分辨質(zhì)譜儀：美國Thermo-Fisher公司產(chǎn)品；電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

人參皂苷Rg1、Rg2、Rg3、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rh1、Rh2、Rk1、Ro、F1、F2以及偽人參皂苷F11：南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品；4年生新鮮西洋參：產(chǎn)自吉林省撫松縣；乙腈(色譜純)：德國Merck公司產(chǎn)品；甲醇、甲酸(色譜純)：美國Themo-Fisher公司產(chǎn)品；實驗用水：超純水，由美國Milli-Q超純水系統(tǒng)制得；水飽和正丁醇：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

1.2 對照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷Rg1、Rg2、Rg3、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rh1、Rh2、Rk1、Ro、F1、F2及偽人參皂苷F11各1 mg，分別用甲醇定容至1 mL，制成1 g/L對照品溶液，備用。

1.3 供試品溶液的制備

將西洋鮮參洗凈、晾干、分級，選擇主根直徑1.0～1.5 cm鮮參(約350 g)，在不同蒸制溫度(80、100、120 ℃)和蒸制時間(2、4、6 h)下得到相應(yīng)的蒸參水。將得到的蒸參水用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于60 ℃濃縮至50 mL，然后用150 mL水飽和正丁醇溶液萃取3次，第1次萃取靜置過夜，取上層溶液合并，于60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，振蕩混勻，定容至5 mL，備用。測定前用甲醇稀釋至一定倍數(shù)，過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.4 實驗條件

1.4.1 色譜條件 Thermo Scientific Syncronis C18色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)；流動相： 0.1%甲酸水溶液(A)，乙腈(B)；梯度洗脫程序：0～10 min(10～20%B)，10～40 min(20～100%B)，40～50 min(100%B)；流速0.2 mL/min；進樣量5 μL；柱溫35 ℃。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式，噴霧電壓2.5 kV，毛細(xì)管溫度320 ℃，透鏡電壓50 V，鞘氣流速40 arb，輔助氣流速10 arb，輔助氣溫度300 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z150.0～2 000.0，質(zhì)譜分辨率70 000。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系考察

分別取適量人參皂苷Rg1、Rg2、Rg3、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rh1、Rh2、Rk1、Ro、F1、F2、偽人參皂苷F11對照品溶液，配制成混合對照品溶液。分別精密吸取2、4、6、8、10 μL混合對照品溶液，用甲醇定容至1 mL，稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.4節(jié)條件測定，以色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，回歸方程及相關(guān)系數(shù)列于表1。

表1 線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)r2、檢出限(LODs)和定量限(LOQs)Table 1 Linear regression equations, linear range, correlation coefficients (r2), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs)

2.2 精密度實驗

精密吸取5 μL同一混合對照品溶液，重復(fù)進樣5次，計算各色譜峰峰面積值的RSD值。結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1、Rg2、Rg3、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rh1、Rh2、Rk1、Ro、F1、F2和偽人參皂苷F11峰面積的RSD值分別為1.85%、1.64%、1.22%、1.39%、1.78%、0.99%、1.66%、0.95%、1.32%、0.97%、1.47%、0.91%、1.63%、1.02%、1.09%，表明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性實驗

精密吸取5 μL同一供試品溶液，分別于0、8、16、24、32、40、48 h 進樣，測定峰面積，計算色譜峰峰面積值的RSD值。結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1、Rg2、Rg3、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rh1、Rh2、Rk1、Ro、F1、F2和偽人參皂苷F11峰面積的RSD值分別為3.18%、4.03%、4.12%、2.58%、3.65%、1.94%、3.70%、3.01%、2.33%、1.84%、2.53%、3.05%、3.56%、2.99%、3.80%，表明樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 重復(fù)性實驗

取5份同一供試品，按照1.3節(jié)方法制備供試品溶液，按照1.4節(jié)條件進行測定。結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1、Rg2、Rg3、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rh1、Rh2、Rk1、Ro、F1、F2和偽人參皂苷F11的RSD值分別為2.96%、3.04%、2.59%、2.77%、0.98%、1.98%、3.10%、1.59%、3.25%、2.24%、2.80%、2.43%、2.25%、2.68%、3.00%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收率測定

精密量取6份已知含量的同一供試品溶液，分別加入0.6、0.8、1.0 mL 1.2節(jié)混合對照品溶液，然后用甲醇定容至5 mL，按照1.4節(jié)條件分析。結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1、Rg2、Rg3、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rh1、Rh2、Rk1、Ro、F1、F2和偽人參皂苷F11的平均回收率分別為96.96%、94.38%、95.85%、97.41%、102.00%、100.59%、99.62%、97.47%、102.1%、101.83%、101.20%、96.87%、98.88%、99.28%、100.64%，RSD值分別為3.00%、2.56%、2.38%、2.93%、2.87%、2.50%、2.09%、2.37%、2.71%、2.52%、3.10%、2.84%、2.22%、2.69%、2.38%。

2.6 西洋參蒸參棄液含量測定

取9組按1.3節(jié)方法制備的供試品溶液，按1.4節(jié)條件測定，得到的總離子流圖示于圖1。各單體皂苷的色譜保留時間和高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)列于表2，9組西洋參蒸參棄液中皂苷含量的測定結(jié)果列于表3。在負(fù)離子模式下的一級質(zhì)譜圖中，人參皂苷均產(chǎn)生[M+HCOO]-離子，質(zhì)量精度誤差小于3.0×10-6，可以實現(xiàn)化合物的定性分析。西洋參中含有的皂苷類成分主要為三萜皂苷，依據(jù)其結(jié)構(gòu)的不同可分為3組：達(dá)瑪烷型(Dammarane)、齊墩果烷型(Oleanane)和奧克梯隆型(Ocotillol)。達(dá)瑪烷型皂苷又可分成2類：原人參二醇型(Protopanaxdiol, PPD)和原人參三醇型(Protopanaxtriol, PPT)。原人參二醇型皂苷主要包括：人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg3、F2、Rk1、Rh2；原人參三醇型皂苷主要包括：人參皂苷Re、Rg1、Rg2、Rh1、F1；偽人參皂苷F11屬奧克梯隆型；人參皂苷Ro為齊墩果烷型。

不同蒸制溫度和蒸制時間對蒸參棄液濃縮物中15種人參皂苷單體的含量有重要的影響：原人參二醇型人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、F2的含量隨著蒸制溫度的升高和蒸制時間的延長而降低，人參皂苷Rg3、Rh2、Rk1、Rd的含量則呈現(xiàn)先增加后降低，或先降低后增加的趨勢。該結(jié)果說明，在蒸制過程中，皂苷之間發(fā)生了一定程度的化學(xué)轉(zhuǎn)化，C20和C3位糖基取代易發(fā)生水解反應(yīng)失去一分子糖殘基，并且C20位羥基易發(fā)生脫水反應(yīng)，形成雙鍵。與此相似，原人參三醇型人參皂苷Re和Rg1隨著蒸制溫度的升高和蒸制時間的延長，可水解為人參皂苷Rg2和Rh1，人參皂苷Rg2和Rh1亦可進一步水解、失水生成分子質(zhì)量更小的不飽和人參皂苷。結(jié)合相關(guān)文獻[20-23]，推測的西洋參蒸參棄液中原人參二醇型和原人參三醇型人參皂苷的轉(zhuǎn)化反應(yīng)示于圖2。偽人參皂苷F11和人參皂苷Ro在蒸制過程中也發(fā)生了糖苷鍵斷裂，生成相對分子質(zhì)量較小的皂苷而導(dǎo)致其含量降低。由此可見，長時間高溫蒸制對稀有人參皂苷的生成具有促進作用。

圖1 不同蒸制溫度、蒸制時間的西洋參蒸參棄液的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of steamed Panax quinquefoliums L. waste liquid under different temperatures and times

類型Type人參皂苷Ginsenoside保留時間tR/min分子式Molecularformula[M-H]-(m/z)CalculatedvalueMeasuredvalue偏差Error/×10-6原人參二醇型人參皂苷Rb125.91C54H92O231107.59521107.59721.81人參皂苷Rb227.83C53H90O221077.58461077.58752.69人參皂苷Rc26.88C53H90O221077.58461077.58712.32人參皂苷Rd30.63C48H82O18945.5423945.54462.43人參皂苷Rg338.11C42H72O13783.4895783.50962.57人參皂苷F236.83C42H72O13783.4895783.50842.41人參皂苷Rk141.33C42H70O12766.4946766.49682.87人參皂苷Rh242.70C36H62O8621.4367621.43791.93原人參三醇型人參皂苷Re19.72C48H82O18945.5423945.54512.96人參皂苷Rg119.78C42H72O14799.4844799.48591.88人參皂苷Rg226.58C42H72O13783.4895783.50662.18人參皂苷Rh127.11C36H62O9637.4316637.43322.51人參皂苷F130.03C36H62O9637.4316637.43292.04奧克梯隆型偽人參皂苷F1124.74C42H72O14799.4844799.48612.13齊墩果烷型人參皂苷Ro27.32C48H76O19955.4904955.49262.30

表3 西洋參蒸參棄液中人參皂苷的含量Table 3 Contents of ginsenosides in steamed Panax quinquefolium L. waste liquid

注：樣品S-1～S-9對應(yīng)的蒸制溫度和蒸制時間與圖1相同

圖2 二醇型、三醇型、齊墩果烷型和奧克梯隆型人參皂苷的化學(xué)轉(zhuǎn)化流程Fig.2 Chemical conversions of PPD, PPT, OLE and OCO types ginsenosides

3 結(jié)論

本研究采用UPLC Orbitrap HRMS法測定西洋參蒸參棄液濃縮物中人參皂苷的含量。西洋參在蒸制過程中，人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Re、Rg1、F11、Ro作為前體化合物轉(zhuǎn)化生成了相應(yīng)的產(chǎn)物皂苷，如Rg3、Rh1、Rh2、Rk1等，這些稀有人參皂苷具有較高的生物活性，是原藥材中所沒有的。本方法方便、快速，定性定量結(jié)果準(zhǔn)確，可為蒸參棄液的充分利用提供重要依據(jù)。

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Analysis of Ginsenosides in SteamedPanaxquinquefoliumsL. Liquid Waste Concentrates by UPLC Orbitrap HRMS

ZHANG Yong1, HUANG Xin1, LI Shuai-ping1, LIU Shu-ying1,2

(1.ChangchunUniversityofChineseMedicine,JilinGinsengAcademy,Changchun130117,China;2.ChangchunCenterofMassSpectrometry,ChangchunInstituteofAppliedChemistry,ChineseAcademyofSciences,Changchun130022,China)

A method was applied to determine the contents of 15 ginsenosides in steamedPanaxquinquefoliumsL. liquid waste concentrates by ultra-performance liquid chromatography-Orbitrap high resolution mass spectrometry (UPLC Orbitrap HRMS). The sample was separated on Thermo Scientific Syncronis C18 column (100 mm×2.1 mm×1.7 μm) with the gradient elution of acetonitril-0.1% formic acid as mobile phases, and the flow rate was 0.2 mL/min. The column temperature was set at 35 ℃. The electrospray ionization (ESI) and the Orbitrap mass analyzer were used with high resolution mass data collection. Ginsenosides Rg1、 Rg2、 Rg3、 Rb1、 Rb2、 Rc、 Rd、 Re、 Rh1、 Rh2、 Rk1、 Ro、 F1、 F2and pseudo ginsenoside F11show good linear relationship, respectively. The average RSD value of stability test is less than 5% within 48 h. The average sample recovery was in the range of 94.38%-102.10%, and the RSD value is less than 3%. The contents of 15 ginsenosides in steamedPanaxquinquefoliumsL. liquid waste concentrates under different temperatures and times were determined and compared. For the protopanaxdiol (PPD) type ginsenosides, with the rising of steaming temperature and time, the contents of Rb1, Rb2, Rc, Rd and F2decreased gradually. While the contents of Rg3, Rh2, Rk1and Rd increased firstly and then decreased or decreased firstly and then increased. The ginsenoside transformation could explain the content more or less. The protopanaxtriol (PPT), oleanane and ocotillol types ginsenosides presented the similar conversion pathway. The chemical conversion of four types of ginsenosides were summarized. This method is simple, accurate, sensitive, specific and has good repeatability, which could be used to determine the contents of ginsenosides in steamedPanaxquinquefoliumsL. liquid waste and proved to be effective for detection of the steamedPanaxquinquefoliumsL. liquid waste concentrates. The steamedPanaxquinquefoliumsL. liquid waste concentrates includes a variety of ginsenosides, of which the minor ginsenosides have higher bioactivities. So the steamedPanaxquinquefoliumsL. liquid waste is of great value to develop. It also provides raw materials for medicine and health products.

ultra-performance liquid chromatography/Orbitrap high resolution mass spectrometry (UPLC Orbitrap HRMS); steamedPanaxquinquefoliumsL. liquid waste; ginsenoside

2016-07-06;

2016-10-21

國家自然科學(xué)基金面上項目(21475012)；吉林省科技發(fā)展計劃項目(20160520181JH)；吉林省教育廳"十三五"科學(xué)技術(shù)研究項目(吉教科合字[2016]第30號)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費項目(20130311106)資助

張 勇(1991—)，女(漢族)，吉林人，碩士研究生，從事中藥化學(xué)研究。E-mail: 18243184649@163.com

劉淑瑩(1943—)，女(漢族)，黑龍江人，研究員，從事中藥化學(xué)和有機質(zhì)譜學(xué)研究。E-mail: syliu@ciac.ac.cn

黃 鑫(1981—)，女(漢族)，吉林人，助理研究員，從事天然產(chǎn)物化學(xué)和質(zhì)譜學(xué)研究。E-mail: huangxinrose@163.com

O657.63

A

1004-2997(2017)01-0052-08

10.7538/zpxb.2017.38.01.0052