劉娟秀，羅益遠，劉訓紅，宋建平，華愉教，王勝男，趙 慧，嚴 穎

(1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210023；2.鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院，江蘇 鹽城 224006)

基于UPLC-Triple TOF MS/MS技術(shù)分析蒼耳子炒制前后的差異化學成分

劉娟秀1，羅益遠1，劉訓紅1，宋建平2，華愉教1，王勝男1，趙 慧1，嚴 穎1

(1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210023；2.鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院，江蘇 鹽城 224006)

為探討蒼耳子炒制前后化學成分的變化，采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間高分辨質(zhì)譜(UPLC-Triple TOF MS/MS)法，結(jié)合多元統(tǒng)計分析技術(shù)，對蒼耳子炒制前后化學成分的差異性進行分析。通過分析二級串聯(lián)質(zhì)譜，針對峰匹配、峰對齊、濾噪處理等進行特征峰提取；采用主成分分析(PCA)和偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)法進行數(shù)據(jù)處理；根據(jù)一級質(zhì)譜精確質(zhì)荷比和二級質(zhì)譜碎片信息，結(jié)合軟件數(shù)據(jù)庫搜索、標準品比對及相關(guān)文獻數(shù)據(jù)進行成分鑒定。結(jié)果表明，蒼耳子炒制前后的化學組成得到了有效區(qū)分，初步篩選出44個差異化學成分，并鑒定出其中的41個成分；所分析的樣品共有10個差異化學成分，在不同樣品中呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。該方法可為解析蒼耳子藥材的品質(zhì)形成機制提供基礎(chǔ)資料，也可為解釋蒼耳子炒制減毒的科學內(nèi)涵提供依據(jù)。

蒼耳子；炒制；超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間高分辨質(zhì)譜法(UPLC-Triple TOF MS/MS)；差異化學成分

蒼耳子系菊科植物蒼耳(XanthiumsibiricumPatr.)的干燥成熟帶總苞的果實，是中醫(yī)臨床常用藥材，收載于2015年《中國藥典》，具散風寒、通鼻竅、祛風濕之功效，為歷代治療鼻淵及頭痛的要藥[1]。蒼耳子化學成分復(fù)雜，主要含有酚酸類、倍半萜內(nèi)酯類、揮發(fā)油、脂肪油和水溶性苷類等[2-4]?，F(xiàn)代研究表明，酚酸類成分具有抗炎、抗菌和抗血栓等作用[5-7]；蒽醌類成分具有抗菌消炎、抗病毒、降血脂和增加免疫力等作用[8]；黃酮類成分具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等作用[9-10]。蒼耳子資源豐富，臨床使用量大，但其生品藥材有毒，經(jīng)炒制后可降低毒性。目前，蒼耳子炮制規(guī)范及制品質(zhì)量標準尚不完善，炒制過程缺乏客觀、科學的工藝參數(shù)，導(dǎo)致藥材質(zhì)量參差不齊，難以實現(xiàn)商品藥材標準化及保障臨床使用的有效性。

目前，對蒼耳子藥材的質(zhì)量評價及炮制研究主要集中在環(huán)烯醚萜苷、苯丙素苷及有機酸等幾種指標成分的含量測定[11-17]以及其指紋圖譜分析[18]，分析方法多為高效液相色譜(HPLC)法[11-14,19]或高效毛細管電泳(HPCE)法[15]，尚未見蒼耳子炮制前后化學成分的整體變化或顯著差異化學成分的研究報道。其中，HPLC法操作簡便、靈敏度較高；HPCE法載樣量小、柱效高、分辨率好，但重現(xiàn)性差、靈敏度較低。以上兩種方法主要用于定量分析，定性分析則需要標準品對照。液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)廣泛用于中藥復(fù)雜體系的定性和定量分析，常用的質(zhì)譜技術(shù)有四極桿質(zhì)譜、離子阱質(zhì)譜、飛行時間質(zhì)譜及復(fù)合式串聯(lián)質(zhì)譜等[20]。其中，低分辨率的四極桿質(zhì)譜和離子阱質(zhì)譜得到的碎片離子較少，而高分辨率質(zhì)譜能夠測得化合物的精確分子質(zhì)量，進而獲得化合物的分子式。根據(jù)多級質(zhì)譜給出的化合物碎片信息，并結(jié)合相關(guān)文獻[21]資料，可快速鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。近年來，超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間高分辨質(zhì)譜(UPLC-Triple TOF MS/MS)法已成為植物代謝組學研究的重要手段之一。

植物代謝組學技術(shù)是對植物抽提物中代謝組進行高通量、無偏差、全面分析的技術(shù)，可用于研究生物整體、系統(tǒng)或器官的內(nèi)源性代謝物質(zhì)的代謝途徑及其所受內(nèi)在或外在因素的影響，該技術(shù)也適用于中藥多組分復(fù)雜體系的分析。

本研究借鑒植物代謝組學的思路和方法，采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間高分辨質(zhì)譜法分析蒼耳子炒制前后化學成分的變化。通過多元統(tǒng)計分析找出變化顯著的差異化學成分，并探討其變化規(guī)律，希望為揭示蒼耳子炒制前后化學成分變化規(guī)律及其品質(zhì)形成機制提供基礎(chǔ)資料。

1 實驗部分

1.1 儀器和材料

SHIMADZU SIL-20A XR超快速液相色譜儀：日本島津公司產(chǎn)品，配有DGU-20A3脫氣裝置，LC-20AD XR液相，SIL-20A XR 自動進樣器，CTO-20AC 柱溫箱；Triple Q-TOF 5600 質(zhì)譜儀：美國AB Sciex公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源(ESI)系統(tǒng)，Analyst Software TF1.6數(shù)據(jù)采集處理工作站；BSA224S型電子分析天平：德國Sartorius公司產(chǎn)品；KQ-500E型超聲波清洗器(功率500 W，頻率40 kHz)：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海滬粵明科學儀器有限公司產(chǎn)品；湘儀H1650-W高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品。

甲醇，甲酸：均為質(zhì)譜純，德國Merck公司產(chǎn)品；實驗用水：超純水，由Millipore純水器制備。

蒼耳子樣品分為商品藥材和實地采集兩種，均由南京中醫(yī)藥大學劉訓紅教授鑒定為菊科植物蒼耳XanthiumsibiricumPatr.的成熟帶總苞的果實，樣品信息列于表1。其中，S8為S4根據(jù)《中國藥典》2015版一部的炒蒼耳子制法制得的對應(yīng)炮制品。每種樣品平行取3份進行分析，留樣憑證存放于南京中醫(yī)藥大學中藥鑒定實驗室。

表1 蒼耳子藥材樣品詳情Table 1 Sample details of Xanthii Fructus

1.2 實驗條件

1.2.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相：甲醇(A)，0.2%甲酸水溶液(B)；梯度洗脫程序：0～10 min(20%～30%A)，10～20 min(30%～35%A)，20～30 min(35%～80%A)，30～45 min(80%～100%A)，45～48 min(100%～20%A)；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量10 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)負離子模式，質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 000，噴霧電壓5.0 kV，氣簾氣流速30 L/min，霧化氣流速55 L/min，輔助氣流速55 L/min，離子源溫度500 ℃，碰撞室射出電壓(CXP)9 V，去簇電壓(DP)100 V。

1.3 供試品溶液的制備

精密稱取1.0 g藥材粉末(已過3號篩)，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入40 mL甲醇，稱其質(zhì)量；在室溫下超聲提取30 min后取出，放冷，用甲醇補足質(zhì)量損失，靜置冷卻；以12 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.4 方法學考察

1.4.1 精密度實驗 精密吸取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6次，對各主要色譜峰的峰面積進行積分，計算其相對保留時間和相對峰面積的RSD值，考察儀器的精密度。

1.4.2 穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一供試品溶液，分別于第0、4、8、12、24 h進樣檢測，對各主要色譜峰的峰面積進行積分，計算其相對保留時間和相對峰面積的RSD值，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。

1.4.3 重復(fù)性實驗 精密稱取1 g蒼耳子樣品，按1.3節(jié)方法制備6份供試品溶液，色譜分析后，對各主要色譜峰的峰面積進行積分，計算其相對保留時間和相對峰面積的RSD值，考察樣品制備的重復(fù)性。

1.5 譜圖處理與統(tǒng)計分析

將原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)和色譜圖導(dǎo)入Peakview 1.2 數(shù)據(jù)處理工作站進行峰匹配、峰對齊、濾噪等處理，結(jié)果保存為文本格式，然后將文本文件調(diào)整后導(dǎo)入SIMCA-P 13.0軟件進行分析。采用主成分分析(PCA)法，通過初步觀察各樣品的聚集情況，直觀地表達蒼耳子炒制前后的化學成分差異；采用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)法對各樣品進行分類，其中R2X、R2Y越接近1，表示模型越穩(wěn)定，Q2>0.5表示預(yù)測率高。根據(jù)PLS-DA模型得到的變量權(quán)重值(VIP>1)找到潛在的差異化學成分，采用t檢驗法驗證多維統(tǒng)計中的差異化學成分是否在單維統(tǒng)計中具有顯著性差異，其中P<0.05表示有顯著性差異。

1.6 差異化學成分的鑒定

通過一級質(zhì)譜確定精確的相對分子質(zhì)量，二級質(zhì)譜獲得裂解信息，結(jié)合HMDB(http:∥www.hmdb.ca/)和METLIN(http:∥metlin.Scripps.edu/)數(shù)據(jù)庫搜索、標準品比對及相關(guān)文獻報道，確定或推測化合物結(jié)構(gòu)信息。共有差異成分的含量以各樣品對應(yīng)的峰強度數(shù)值表示，通過對生蒼耳子與炒蒼耳子樣品間同一物質(zhì)峰強度的平均值和標準差進行計算，得到共有差異成分在蒼耳子炒制前后的相對含量變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.2%甲酸水等溶液作為流動相時對樣品中各峰分離度的影響。結(jié)果表明，在流動相中加入一定比例的甲酸可增強樣品中待測物的保留，并減少色譜峰拖尾。采用甲醇-0.2%甲酸水溶液作為流動相時，峰形較好且可達到良好的分離效果。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別考察了樣品中化學成分在正、負離子模式下的響應(yīng)情況。結(jié)果表明，負離子模式比正離子模式能提供更多的質(zhì)譜峰信息，故本實驗采用負離子模式進行分析。蒼耳子炒制前后樣品的UPLC-Triple TOF MS/MS 基峰強度離子流(BPI)色譜圖示于圖1。

2.3 供試品處理方法的優(yōu)化

分別考察了甲醇、70%甲醇、50%甲醇3種溶液作為提取溶劑的情況，結(jié)果表明，以甲醇為溶劑的色譜峰峰形優(yōu)于其他兩種溶劑。還考察了超聲提取30、60、90 min對提取效果的影響，結(jié)果表明，超聲提取30 min與其他兩種超聲時間的提取效果無明顯差異。同時考察了料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40對提取效率的影響，結(jié)果表明，料液比為1∶40時具有較高的提取效率。

2.4 方法學考察結(jié)果

按1.4節(jié)方法考察方法的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性，結(jié)果顯示，各項實驗中主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于2%，這表明儀器精密度良好，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定且方法重復(fù)性良好。

2.5 主成分分析(PCA)

采用PCA多變量模式識別方法對蒼耳子炒制前后樣品進行降維分析，其得分圖示于圖2。由圖2可見，生蒼耳子與炒蒼耳子樣品可以被明顯地分開，生蒼耳子樣品位于PC1軸的負方向，炒蒼耳子樣品位于PC1軸的正方向，而且各自聚為一類，這說明炒制前后蒼耳子化學組成明顯不同。生蒼耳子樣品分布相對比較集中，說明組內(nèi)均一性較好，即化學物質(zhì)組成相近；而炒蒼耳子樣品分布相對比較分散，即組內(nèi)樣品化學成分組成差異相對較大，這可能是由炒蒼耳子商品藥材缺乏統(tǒng)一的炮制規(guī)范和工藝參數(shù)導(dǎo)致的。

2.6 偏最小二乘判別分析(PLS-DA)

為進一步證實蒼耳子炒制前后樣品中化學成分的差異性，采用有監(jiān)督的模式識別方法PLS-DA來分析確定蒼耳子炒制前后樣品間的差異化學成分，其得分圖示于圖3。在圖3中，生蒼耳子與炒蒼耳子樣品沿PC1軸明顯分開，其模型參數(shù)為R2X(cum)=0.904，R2Y(cum)=0.982，Q2(cum)=0.891，證明模型有效可靠。與模型相對應(yīng)的柱狀載荷圖示于圖4，采用常用的變量載荷評價參數(shù)(VIP)值來描述變量的貢獻程度，當VIP>1時，認為存在潛在的差異化學成分。通過VIP值和柱狀載荷圖對兩組樣品中的差異化學成分進行考察，初步篩選出44個差異化學成分。

注：a.生蒼耳子；b.炒蒼耳子圖1 蒼耳子炒制前后UPLC-Triple TOF-MS/MS 基峰強度離子流BPI色譜圖Fig.1 UPLC-Triple TOF MS/MS base peak intensity (BPI) chromatogramsof Xanthii Fructus before and after stir-frying

注：a.生蒼耳子；b.炒蒼耳子S1.□；S2.◇；S3.○；S4.*；S5.▲；S6.■；S7.◆；S8.△圖2 負離子模式下蒼耳子炒制前后的PCA得分圖Fig.2 PCA scores of Xanthii Fructus before and after stir-frying in negative ion mode

注：a.生蒼耳子；b.炒蒼耳子S1.□；S2.◇；S3.○；S4.*；S5.▲；S6.■；S7.◆；S8.△圖3 蒼耳子炒制前后樣品的PLS-DA得分圖Fig.3 PLS-DA scores of Xanthii Fructus before and after stir-frying

2.7 差異化學成分的鑒定

通過HMDB和METLIN數(shù)據(jù)庫結(jié)合已有的文獻[22-29]搜索差異化學成分的精準質(zhì)荷比，對VIP>1的44個差異顯著化學成分進行結(jié)構(gòu)鑒定，初步鑒定出其中的41個化學成分，其質(zhì)譜數(shù)據(jù)列于表2。

2.8 共有差異化學成分的相對含量變化分析

所分析的8個蒼耳子炒制前后樣品中共有10種差異化學成分，包括甘草素-4′-O-芹糖-O-葡萄糖苷、3′,4′,5,7-四甲氧基黃酮、綠原酸、脫氧腺苷、隱綠原酸、1,3-二咖啡酰奎寧酸、3,4-二咖啡?？鼘幩帷⒆显朴④?、4′-去磺基蒼術(shù)苷和β-胡蘿卜素。以共有差異成分的峰強度數(shù)值代表其含量，對生蒼耳子和炒蒼耳子樣品間同一物質(zhì)峰強度的平均值和標準差進行計算和作圖，得到各共有差異成分在蒼耳子炒制前后后樣品間含量的變化情況，示于圖5。由圖5可見，10種差異化學成分中，甘草素-4′-O-芹糖-O-葡萄糖苷、脫氧腺苷、1,3-二咖啡酰奎寧酸、3,4-二咖啡?？鼘幩?、紫云英苷及β-胡蘿卜素的相對含量在炒制品中較高；而3′,4′,5,7-四甲氧基黃酮、綠原酸、隱綠原酸及4′-去磺基蒼術(shù)苷的相對含量在生品中較高。

3 結(jié)論

本實驗采用UPLC-Triple TOF MS/MS聯(lián)用技術(shù)分析蒼耳子炒制前后化學成分的差異，初步確定出41個差異顯著的化學成分，在蒼耳子炒制前后的8個樣品中共同含有10個差異化學成分，其相對含量呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。炒制后的樣品中，甘草素-4′-O-芹糖-O-葡萄糖苷、脫氧腺苷、1,3-二咖啡?？鼘幩帷?,4-二咖啡?？鼘幩?、紫云英苷和β-胡蘿卜素的含量增高，這可能是蒼耳子“炒制增效”的物質(zhì)基礎(chǔ)；而3′,4′,5,7-四甲氧基黃酮、綠原酸、隱綠原酸及4′-去磺基蒼術(shù)苷的含量降低。蒼術(shù)苷是蒼耳子的主要毒性成分之一，4′-去磺基蒼術(shù)苷為蒼術(shù)苷在酸性條件下解離出K+，然后脫去一分子磺酸基而得，炒制樣品中4′-去磺基蒼術(shù)苷含量顯著降低，這可能是蒼耳子“炒制減毒”的原因之一。該方法能夠找出蒼耳子炒制前后差異顯著的化學成分，并揭示其變化規(guī)律，可為解析蒼耳子藥材的品質(zhì)形成機制提供基礎(chǔ)資料，也可為解釋蒼耳子炒制減毒的科學內(nèi)涵提供依據(jù)。

圖4 蒼耳子炒制前后樣品的PLS-DA柱狀載荷圖Fig.4 PLS-DA contribution loading plot of Xanthii Fructus before and after stir-frying

注：a.生蒼耳子；b.炒蒼耳子1.甘草素-4′-O-芹糖-O-葡萄糖苷；2. 3′,4′,5,7-四甲氧基黃酮；3.綠原酸；4.脫氧腺苷；5.隱綠原酸；6.1,3-二咖啡酰奎寧酸；7.3,4-二咖啡酰奎寧酸；8.紫云英苷；9. 4′-去磺基蒼術(shù)苷；10. β-胡蘿卜素圖5 蒼耳子炒制前后樣品中共有差異化學成分的相對含量Fig.5 Relative contents of different chemical constituents in Xanthii Fructus before and after stir-frying

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Differences of Chemical Compositions inXanthiiFructusbefore and after Stir-Frying by UPLC-Triple TOF MS/MS

LIU Juan-xiu1, LUO Yi-yuan1, LIU Xun-hong1, SONG Jian-ping2, HUA Yu-jiao1, WANG Sheng-nan1, ZHAO Hui1, YAN Ying1

(1.NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China;2.YanchengHealthVocational&TechnicalCollege,Yancheng224006,China)

The method of UPLC-Triple TOF MS/MS combined with multivariate statistical analysis was used to study the differences of chemical compositions inXanthiiFructusbefore and after stir-frying. Through the analysis of the multistage tandem mass spectrometry, the characteristic peaks were extracted with mass spectrometry data peak matching, peak alignment, noise filtering. Principal component analysis (PCA) and partial least-squares discriminant analysis (PLS-DA) were used for data processing. The chemical compositions were identified and tentative presumed according to MS accurate mass and MS/MS spectrometry fragmentation information, combined with the software of database search and comparison with reference standards and literature. The results show that the chemical compositions inXanthiiFructusbefore and after stir-frying are clearly distinguished. A total of 44 different chemical compositions are detected inXanthiiFructusbefore and after stir-frying, and 41 chemical compositions of which are identified. Among of them, there are 10 kinds of common differential compositions, such as liquiritigenin 4′-O-apiosyl-O-glucoside, 3′,4′,5,7-tetramethoxyflavone, chlorogenic acid, deoxyadenosine, 4-dicaffeoylquinic acid, 1,3-dicaffeoylquinic acid, 3,4-dicaffeoylquinic acid, astragalin, 4′-desulphate-atractylosid andβ-carotene, which present different change laws. In the 10 differential components, the contents of liquiritigenin 4′-O-apiosyl-O-glucoside, deoxyadenosine, 1,3-dicaffeoylquinic acid, 3,4-dicaffeoylquinic acid, astragalin, andβ-carotene are much higher inXanthiiFructusafter stir-frying, while the contents of 3′,4′,5,7-tetramethoxyflavone, chlorogenic acid, 4-dicaffeoylquinic acid, and 4′-desulphate-atractylosid are lower. This study provides a basic information for revealing the change law of chemical compositions inXanthiiFructusbefore and after stir-frying.

XanthiiFructus; stir-frying; UPLC-Triple TOF-MS/MS; chemical compositions

2016-05-09;

2016-10-05

江蘇高校優(yōu)勢學科建設(shè)工程項目(YSXK-2014)；江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程項目(PPZY2015A070)；鹽城市醫(yī)學科技發(fā)展計劃項目(YK2014051)資助

劉娟秀(1990—)，女(漢族)，江蘇人，碩士研究生，生藥學專業(yè)。E-mail: liujx0516@163.com

劉訓紅(1959—)，男(漢族)，江蘇人，教授，從事中藥鑒定與品質(zhì)評價研究。E-mail: liuxunh1959@sohu.com

O657.63

A

1004-2997(2017)01-0157-12

10.7538/zpxb.2017.38.01.0157