馬 悅，趙樂鳳，呂子燕，孫 樂，吳 巍，劉淑瑩,2

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，長(zhǎng)春質(zhì)譜中心，吉林 長(zhǎng)春 130022)

高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜分析桑葚中黃酮類和多酚類物質(zhì)

馬 悅1，趙樂鳳1，呂子燕1，孫 樂1，吳 巍1，劉淑瑩1,2

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，長(zhǎng)春質(zhì)譜中心，吉林 長(zhǎng)春 130022)

為了更好地利用桑葚這一藥食同源果品，采用高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜對(duì)桑葚提取物中黃酮類和多酚類成分進(jìn)行分析研究。采用Syncronis C18 色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，流速0.2 mL/min，梯度洗脫分析。根據(jù)高分辨質(zhì)譜提供的準(zhǔn)分子離子峰和碎片離子信息，分析得到化合物的相對(duì)分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)信息。結(jié)合化合物的保留時(shí)間、對(duì)照品和相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，共鑒定出5種黃酮類成分和3種多酚類成分，分別為蘆丁、異槲皮素、山奈酚-7-葡萄糖苷、二氫槲皮素、槲皮素、原兒茶酸、綠原酸和咖啡酸。通過討論化合物的質(zhì)譜碎裂規(guī)律，為化合物的結(jié)構(gòu)鑒定提供依據(jù)。該方法可快速分析桑葚中黃酮類和多酚類成分，為合理開發(fā)桑葚的藥用、食用價(jià)值奠定化學(xué)基礎(chǔ)。

桑葚；高效液相色譜；四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜；黃酮；多酚

桑葚(mulberry)為?？浦参锷orusalbaL.的干燥果穗[1]，味甘酸、性寒，歸心、肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)肝益腎、養(yǎng)血生津之功效[2]。近年來，桑葚作為一種新型果品，其獨(dú)特的保健作用引起人們的廣泛關(guān)注[3]。桑葚含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分,如氨基酸、礦物質(zhì)、維生素、微量元素、生物堿、多酚類、黃酮類等[4]，因此它具有良好的藥用價(jià)值。《中國(guó)藥典》中采用85%乙醇提取桑葚，提取物具有滋陰補(bǔ)血、生津潤(rùn)燥的作用，可用于治療肝腎陰虛、眩暈耳鳴等癥狀。目前對(duì)桑葚的研究大多集中在含量測(cè)定、提取分離和藥理活性等方面[5]，也有研究應(yīng)用超聲技術(shù)結(jié)合紫外分光光度法提取和定量分析桑葚中總黃酮的含量，其結(jié)果為1.508 mg/g[6-7]。游元元等[8]利用HPLC法對(duì)不同產(chǎn)地的桑葚藥材進(jìn)行了指紋圖譜分析，并研究了藥材的品質(zhì)、加工和貯存；王欣等[9]采用硅膠等柱色譜法分離鑒定了桑葚95%乙醇提取物中的15種化合物；Thabti等[10]利用HPLC-DAD和HPLC-MS法測(cè)定了桑葉中總多酚和總黃酮的含量，并且分離鑒定了黃酮和多酚類物質(zhì)。但從總體上來看，利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析桑葚中黃酮類有效成分的文獻(xiàn)報(bào)道較少，而研究桑葚中的黃酮類和多酚類物質(zhì)組成，對(duì)桑葚的藥用和食用的質(zhì)量控制與合理開發(fā)具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)擬采用高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法對(duì)桑葚提取物中的黃酮類和多酚類成分進(jìn)行分析，希望為研究桑葚中的化學(xué)物質(zhì)提供快速、直觀、準(zhǔn)確的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Scientific Q-Exactive 四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)，Dionex UltiMate 3000快速液相色譜系統(tǒng)：美國(guó) Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

蘆丁、槲皮素、二氫槲皮素、異槲皮素、原兒茶酸、綠原酸和咖啡酸對(duì)照品：南京澤郎醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品；乙腈：色譜純，美國(guó)Fisher公司產(chǎn)品；甲酸：純度為96%，美國(guó)Tedia公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水：由Milli-Q超純水儀制得，電阻率為18 MΩ·cm；其他試劑均為分析純：北京化工廠產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 色譜條件 Thermo Syncronis C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)；柱溫35 ℃；二元線性梯度洗脫；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；梯度洗脫程序：0～5 min(5%～35%B)，5～30 min(35%～45%B)；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件 Q-Exactive 四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜，ESI 離子源；負(fù)離子模式；霧化溫度300 ℃；離子傳輸管溫度 350 ℃；掃描模式：Full Scan-ddMS2/Targeted-ddMS2；分辨率70 000 FWHM；質(zhì)量掃描范圍m/z50～750。

1.3 樣品制備

精密稱取1 g桑葚粉末，用85%乙醇以料液比1∶20混合，于60 ℃浸提1 h，蒸干溶劑，然后用蒸餾水溶解樣品，加入等量的石油醚萃取3次，棄去石油醚層。向水層部分加入等量的乙酸乙酯萃取3次，蒸干溶劑，加入80%甲醇溶液定容至10 mL，過0.45 μm微孔濾膜，得樣品溶液，備用。

2 結(jié)果與討論

桑葚提取物在負(fù)離子模式Full Scan/Full Scan-ddMS2/Targeted-ddMS2下的總離子流圖示于圖1。實(shí)驗(yàn)表明，在負(fù)離子模式下，化合物生成[M-H]-準(zhǔn)分子離子，8種化合物均可實(shí)現(xiàn)很好的分離。Q-Exactive四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜的高分辨性能可對(duì)化合物進(jìn)行精確的質(zhì)量數(shù)測(cè)定，以整數(shù)m/z值對(duì)化合物進(jìn)行討論，精確數(shù)值(誤差≤5×10-6)列于表1?；衔?～8產(chǎn)生的[M-H]-離子分別為m/z153、353、179、609、463、447、303和301。為進(jìn)一步分析鑒定這些化合物結(jié)構(gòu)，對(duì)8種化合物進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析。

注：1.原兒茶酸；2.綠原酸；3.咖啡酸；4.蘆??；5.異槲皮素；6.山奈酚-7-葡萄糖苷；7.二氫槲皮素；8.槲皮素圖1 負(fù)離子模式下，桑葚乙醇提取物的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram(TIC) of ethanol extraction from mulberry fruit in negative mode

本實(shí)驗(yàn)中黃酮類化合物的質(zhì)譜碎片離子命名方法如下：對(duì)于含有完整黃酮苷元A環(huán)和B環(huán)的子離子，采用Claeys研究小組的命名方法[11]，分別標(biāo)記為i,jA和i,jB，其中，上標(biāo)i和j分別表示C環(huán)上斷裂鍵位置。對(duì)于涉及糖開環(huán)解離的子離子，則采用Domon和Costello研究小組的命名方法[12]，這些子離子分別標(biāo)記為k,lYj、k,lZj(糖苷鍵斷裂)和k,lXj(糖開環(huán)裂解)，其中，上標(biāo)k和l表示糖開環(huán)裂解的斷裂鍵位置。

化合物1～3的色譜保留時(shí)間分別為7.08、8.32、9.05 min。在負(fù)離子模式下，準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z153、353、179。通過Full Scan-ddMS2串聯(lián)質(zhì)譜分析，化合物1產(chǎn)生碎片離子m/z109 [M-H-CO2]-，由母離子m/z153失去一個(gè)中性碎片CO(28 u)產(chǎn)生，其串聯(lián)質(zhì)譜圖示于圖2a?；衔?產(chǎn)生碎片離子m/z308 [M-H-CO2]-，是由準(zhǔn)分子離子[M-H]-m/z353失去一個(gè)中性碎片CO2(44 u)產(chǎn)生的。碎片離子m/z191[quinic acid-H]-為奎尼酸；m/z179[caffeic acid-H]-為咖啡酸；m/z173[quinic acid-H-H2O]-為奎尼酸失去一個(gè)中性碎片H2O(18 u)得到的碎片離子；m/z161[caffeic acid-H2O-H]-為咖啡酸失去一個(gè)中性碎片H2O(18 u)得到的碎片離子；m/z135[caffeic acid-H-CO2]-為咖啡酸失去一個(gè)CO2(44 u)中性離子得到的碎片離子，其質(zhì)譜圖示于圖2b?；衔?產(chǎn)生的離子m/z135 [M-H-CO2]-是準(zhǔn)分子離子[M-H]-失去一個(gè)中性碎片CO2(44 u)得到的，其質(zhì)譜圖示于圖2c。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[13-16]，并與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，依據(jù)化合物的保留時(shí)間和表1中列出的串聯(lián)質(zhì)譜產(chǎn)生的碎片離子及精確質(zhì)量數(shù)，確定化合物1為原兒茶酸，化合物2為綠原酸，化合物3為咖啡酸。

表1 8種化合物的質(zhì)譜碎裂數(shù)據(jù)Table1 Mass spectral fragmentation data of 8 compounds

圖2 8種化合物的二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.2 MS/MS spectras of 8 compounds

化合物4、5、8的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-分別為m/z609、463和301，由此推斷化合物4和5的相對(duì)分子質(zhì)量分別為610和464。通過與文獻(xiàn)[17]和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比，其色譜保留時(shí)間與蘆丁、異槲皮素和槲皮素一致，分別為9.50、9.88、13.46 min。進(jìn)一步分析串聯(lián)質(zhì)譜所產(chǎn)生的碎片離子和精確質(zhì)量數(shù)，可推斷化合物的結(jié)構(gòu)。蘆丁準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z609，在Full Scan-ddMS2串聯(lián)質(zhì)譜中，m/z564[M-H-CO2]-離子為m/z609失去一個(gè)中性碎片CO2(44 u)和一個(gè)H生成的離子；m/z301[M-H-Glc-Rha]-為蘆丁C7位的糖苷鍵發(fā)生B—Y斷裂丟失質(zhì)量數(shù)為308的中性碎片離子生成的苷元[18]。此外，還存在m/z151、179、121三個(gè)碎片離子。經(jīng)分析，m/z151的碎片離子為m/z301離子發(fā)生RDA反應(yīng)生成的；m/z179[M-H-Glc-1,2B-H]-的碎片離子為m/z301在1，2處斷裂且轉(zhuǎn)移2個(gè)H生成的；m/z1211,2B為m/z301在1，2處斷裂產(chǎn)生的離子。綜上，可確定化合物4為蘆丁，其串聯(lián)質(zhì)譜圖示于圖2d?；衔?在串聯(lián)質(zhì)譜中產(chǎn)生的碎片離子m/z301、151、179與異槲皮素一致。其中，m/z301是準(zhǔn)分子離子峰 [M-H]-m/z463丟失一分子葡萄糖殘基(162 u)產(chǎn)生的苷元離子[M-H-Glc]-；m/z151、179離子是苷元C環(huán)開環(huán)裂解產(chǎn)生的離子[19]。由此可確定化合物5為異槲皮素，其串聯(lián)質(zhì)譜圖示于圖2e。

在一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖中，化合物6的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z447，色譜保留時(shí)間為10.33 min。通過Full Scan-ddMS2串聯(lián)質(zhì)譜分析，Y0離子m/z285為失去一分子六碳糖殘基(162 u)碎片產(chǎn)生的離子；m/z257是m/z285丟失中性碎片離子CO(28 u)而產(chǎn)生的[M-H-Glc-CO]-離子，其串聯(lián)質(zhì)譜圖示于圖2f。通過與文獻(xiàn)[19]和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比，該化合物的串聯(lián)質(zhì)譜碎裂規(guī)律符合山奈酚-7-葡萄糖苷的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，因此確定化合物6為山奈酚-7-葡萄糖苷。

化合物7的分子離子峰為[M-H]-m/z303，由此可確定化合物7的相對(duì)分子質(zhì)量為304。通過與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比，可知二氫槲皮素的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z303。經(jīng)Full Scan-ddMS2串聯(lián)質(zhì)譜分析，m/z285[M-H-H2O]-離子是二氫槲皮素4’，5’的鄰羥基失去質(zhì)量數(shù)為18 u(H2O)的中性碎片后產(chǎn)生的離子峰；m/z275[M-H-CO]-為m/z303失去中性碎片CO(28 u)所得的離子峰；m/z259[M-H-CO2]-為m/z303丟失中性碎片CO2(44 u)所得的離子峰；m/z241[M-H-CO2-H2O]-為m/z303丟失中性碎片CO2(44 u)和H2O(18 u)所得的離子峰；m/z1791,4B離子為二氫黃酮母核1，4位開裂所得的離子峰，其質(zhì)譜圖示于圖2g?；衔?的色譜保留時(shí)間為10.65 min，二氫槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜保留時(shí)間為10.67 min，且化合物7 Full Scan-ddMS2串聯(lián)裂解產(chǎn)生的碎片離子與二氫槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品Targeted-ddMS2串聯(lián)產(chǎn)生的碎片離子相同，因此，可確定化合物7為二氫槲皮素。

分析化合物8的二級(jí)質(zhì)譜圖可發(fā)現(xiàn)，離子m/z273[M-H-CO]-為分子離子峰m/z301丟失中性碎片CO(28 u)產(chǎn)生的，m/z273繼續(xù)丟失中性碎片CO產(chǎn)生m/z245離子峰。此外，還存在m/z151、179、121、107四個(gè)碎片離子，經(jīng)分析，碎片離子m/z151為m/z301離子發(fā)生RDA反應(yīng)生成的；m/z151失去中性碎片CO2產(chǎn)生m/z107碎片離子；m/z1791,2A碎片離子為m/z301在1，2處斷裂且轉(zhuǎn)移2個(gè)H生成的；m/z1211,2B為m/z301在1，2處斷裂產(chǎn)生的離子[21]。因此可確定化合物8為槲皮素，其串聯(lián)質(zhì)譜圖示于圖2h。

由表1可見，幾種化合物在二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜中表現(xiàn)出一些特征中性碎片的丟失，如丟失葡萄糖基(162 u)，CO(28 u)、CO2(44 u)和H2O(18 u)等，這些特征碎片可為鑒定桑葚中黃酮類和多酚類化合物提供重要信息。

3 結(jié)論

采用高效液相色譜-四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法對(duì)桑葚中黃酮類和多酚類成分進(jìn)行分析，通過與對(duì)照品的保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)比，并對(duì)一級(jí)全掃描質(zhì)譜中分子離子峰信息和串聯(lián)質(zhì)譜中碎片離子及中性碎片丟失情況進(jìn)行分析，推測(cè)出8種化合物的結(jié)構(gòu)信息，并快速分析鑒定了桑葚中黃酮類和多酚類化合物。該方法可為研究桑葚的化學(xué)物質(zhì)提供快速、直觀、準(zhǔn)確的方法。

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Analysis of Flavonoids and Polyphenols in Mulberry Extracts by High-Performance Liquid Chromatography Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometry

MA Yue1, ZHAO Le-feng1, LV Zi-yan1, SUN Le1, WU Wei1, LIU Shu-ying1,2

(1.JilinGinsengAcademy,ChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun130117,China;2.ChangchunCenterofMassSpectrometry,ChangchunInstituteofAppliedChemistry,ChineseAcademyofSciences,Changchun130022,China)

Mulberry has been widely researched for its unique health care effect. Its 85% ethanol extract is included in the Chinese Pharmacopoeia. A method for analyzing the flavonoids and polyphenols of mulberry extracts was developed by high-performance liquid chromatography quadrupole-Orbitrap mass spectrometry. Most studies of mulberry focused on the content determination, extraction and separation, pharmacological activities, while the analysis of active ingredients in mulberry flavonoids was seldom investigated. Studies have shown that the total content of flavonoids in the mulberry is 1.508 mg/g. The research of flavonoids and polyphenols is of great significance to control the quality of medicinal and edible mulberry as well as to develop the valuable source reasonably. Recently, the HPLC/MS has been proved as an effective method for component analysis in complex extracts system, through which the compounds in mixtures and yield information based on their molecular weights as well as the structures can be rapidly determined. In this study, high-performance liquid chromatography quadrupole-Orbitrap mass spectrometry was adopted for its high speed, high resolution and high sensitivity. It is also effective for compound structure identification online. Analysis of flavonids and polyphenols was performed using H2O-CH3CN containing 0.1% formic acid with 0.2 mL/min flow rate by a Syncronis C18 column (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm). Five flavonoids of rutin, isoquercerin, kaempferol-7-glucoside, taxifolin, quercetin and three polyphenols of 3,4-dihydroxyphenylacetic acid, chlorogenic acid, caffeic acid are identified by retention time, accurate molecular weight, tandem mass spectrometry fragmentation information. The retention times of these eight identified compounds are 7.08, 8.32, 9.05, 9.50，9.88, 10.33 and 13.46 min, respectively. In full MS scan, these eight compounds give [M-H]-ion atm/z153, 353, 179, 609, 463, 447, 303 and 301 in negative ion mode. For the further analysis to identify the structures of these compounds, they were subjected for the tandem mass spectrometry. MS fragmentation patterns of compounds were discussed and it provided basis for their structure identification. Loss of glucose residue (162 u), CO (28 u), CO2(44 u) and H2O (18 u) are characteristic losses for the identification of flavonoids in mulberry which offer the important structural information. This method is rapid, simple, accurate, which can provide chemical foundations for exploitation of mulberry in drugs and foods reasonably.

mulberry; high performance liquid chromatography; quadrupole-Orbitrap mass spectrometry; flavonoids; ployphenols

2016-05-09;

2016-09-23

吉林省科技廳人參化學(xué)與藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室探索項(xiàng)目(20160101334JC)資助

馬 悅(1992—)，女(漢族)，內(nèi)蒙古人，碩士研究生，藥物分析專業(yè)。E-mail: 302572905@qq.com

吳 巍(1974—)，女(漢族)，吉林人，研究員，從事中藥分析研究。E-mail: weiwu_ccucm@126.com；劉淑瑩(1943—)，女(漢族)，黑龍江人，研究員，從事中藥化學(xué)和有機(jī)質(zhì)譜學(xué)研究。E-mail: syliu@ciac.jl.cn

O657.63

A

1004-2997(2017)01-0045-07

10.7538/zpxb.2017.38.01.0045