楊宬苓，張宏祺，陳崇宇，李茂榮

(1.中興大學(xué)化學(xué)系，臺灣 臺中 402；2.朝陽科技大學(xué)銀發(fā)產(chǎn)業(yè)管理系，臺灣 臺中 413)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析貝母中異甾體生物堿成分

楊宬苓1，張宏祺2，陳崇宇1，李茂榮1

(1.中興大學(xué)化學(xué)系，臺灣 臺中 402；2.朝陽科技大學(xué)銀發(fā)產(chǎn)業(yè)管理系，臺灣 臺中 413)

川貝母具有止咳化痰之功效，是經(jīng)濟(jì)價值較高的藥品，因此市場上偶有將低價格貝母摻入其中的行為，因此需要建立一種快速有效的方法用于貝母中異甾體生物堿的分析。本研究采用QuEChERS前處理技術(shù)萃取川貝母樣品中貝母辛、貝母乙素及貝母甲素等異甾體生物堿，并結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)進(jìn)行分析。在QuEChERS優(yōu)化條件下，取0.5 g貝母樣品，添加3 mL含3%氨水的乙酸乙酯-水溶液(75∶25，V/V)，再加入1 g 碳酸銨，振蕩5 min后，以4 000 r/min離心5 min，取1.8 mL上清液，加入20 mg硅酸鎂及10 mg無水硫酸鎂，并以14 000 r/min離心3 min，氮?dú)獯蹈珊螅?0%甲醇水溶液定量至1 mL，采用LC-MS/MS法在正離子掃描模式下檢測。結(jié)果表明：川貝母樣品中貝母辛的線性范圍為0.1～20 μg/g，貝母乙素和貝母甲素的線性范圍為0.05～10 μg/g；線性相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.992 3；檢測限為0.005～0.03 μg/g；日內(nèi)與日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差介于1.1%～17.5%之間；回收率介于89.6%～97.0%之間。應(yīng)用此方法檢測真實(shí)樣品，測得的異甾體生物堿含量中貝母辛為4.35 μg/g，貝母乙素為0.92 μg/g，貝母甲素為1.39 μg/g。該方法具有前處理簡便快速，樣品和有機(jī)溶劑用量少等優(yōu)點(diǎn)，可為其他貝母中生物堿的檢測提供方法參考。

川貝母；異甾體生物堿；QuEChERS；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)

貝母為百合科(Liliaceae)貝母屬(Fritillaria)多年生草本植物的干燥鱗莖，主要分布在北半球溫帶地區(qū)，而川貝母主要分布在四川境內(nèi)海拔3 000～4 000 m的灌木叢和山坡草叢。川貝母具有潤肺止咳、祛痰、平喘、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤之功效，可用于治療久咳、急性氣管炎、支氣管炎等病癥[1]。2010年版《中國藥典》中[2]，將川貝母Fritillariacirrhosa、暗紫貝母Fritillariaunibracteata、甘肅貝母Fritillariaprzewalskii、梭砂貝母Fritillariadelavayi、太白貝母Fritillariataipaiensis和瓦布貝母Fritillariaunibracteata列為川貝母的法定藥材來源，且依據(jù)產(chǎn)地、性狀、大小不同又將其分為松貝、青貝、爐貝，價格也有所差異。由于貝母屬種類不同，其生物堿種類和含量也不同。甾體生物堿為貝母中的生物堿之一，是貝母的主要成分。根據(jù)結(jié)構(gòu)類型，甾體生物堿可分為異甾體(isosteroidal alkaloids)和甾體(steroidal alkaloids)兩大類。其中，異甾體生物堿以雜環(huán)結(jié)構(gòu)不同又分為瑟文型(cevanine group)、介藜蘆型(jervine group)和黎蘆胺型 (secosolanidine group)；甾體生物堿則分為茄堿型(solanidine)和裂環(huán)茄堿型(secosolanidine group)[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)，異甾體生物堿為川貝母的主要有效活性成分。例如，瑟文型貝母甲素、貝母乙素及西貝素可以治療咳嗽和平喘[4]，也有文獻(xiàn)[5]指出，它能夠提高小鼠常壓耐缺氧能力，對氣喘病研究有很大幫助；介藜蘆型貝母辛則具有祛痰功效，已用于抗腫瘤的相關(guān)研究[6]。

目前，生物堿的分析方法主要有氣相色譜技術(shù)(gas chromatography, GC)結(jié)合火焰離子檢測器(flame ionization detector, FID)[7]或電子游離法質(zhì)譜技術(shù)(electron ionization-mass spectrometry, EI-MS)[8]、薄膜色譜技術(shù)(thin layer chromatography, TLC)結(jié)合紫外光可見光檢測器(ultraviolet-visible detector, UV)[9]，但由于大部分異甾體生物堿在結(jié)構(gòu)上缺少共軛鍵，因此TLC-UV的檢測靈敏度較差。由于生物堿的揮發(fā)性差，難以采用GC-FID及GC-EI-MS檢測，必須以衍生化方法加上吸光團(tuán)，使其吸收紫外光或硅烷化，提升其揮發(fā)性和檢測靈敏度。然而衍生化方法不僅增加了樣品的前處理時間，且衍生試劑價格昂貴，不適合用于大量樣品分析。毛細(xì)管電泳技術(shù)(capillary electrophoresis, CE)、高效液相色譜技術(shù)(high performance liquid chromatography, HPLC)[10-12]通常與揮發(fā)性光散射檢測器(evaporative light scattering detector, ELSD)聯(lián)用，但揮發(fā)性光散射檢測器的靈敏度低，且只以滯留時間判定分析物，難以對復(fù)雜基質(zhì)的樣品進(jìn)行定性定量分析。近年來，越來越多的研究采用具有高靈敏度與高選擇性的液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry, LC/MS)聯(lián)用技術(shù)[13-16]進(jìn)行生物堿分析。Zhou等[13]采用液相色譜-電噴霧離子化-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-ESI-TOF)檢測貝母中所含甾體生物堿，利用高分辨質(zhì)譜技術(shù)測得貝母中26種甾體生物堿。Li等[14]利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測17種不同貝母中的27種甾體生物堿，并利用聚類分析法(hierarchial cluster analysis)分析所得結(jié)果，對17種貝母進(jìn)行了分類。Zhou等[15]利用液相色譜-電噴霧離子化-四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-ESI-Q-TOF)探討甾體生物堿的質(zhì)譜斷裂機(jī)制，并鑒定出貝母中所含的41種甾體生物堿。Luo等[16]以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析老鼠血漿中4種異甾體生物堿，測得血漿中異甾體生物堿濃度在0.2～100 μg/L之間。

本研究擬采用QuEChERS萃取和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測貝母樣品中的貝母辛(peimmisine)、貝母乙素(peiminine)、貝母甲素(peimine)等異甾體生物堿，并希望該技術(shù)能應(yīng)用于不同貝母的鑒別。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀、LTQ XL線性離子阱質(zhì)譜儀：美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品。

貝母辛、貝母乙素、貝母甲素：由中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、氨水：均為色譜純，德國Merk公司產(chǎn)品；氯化鈉：美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；無水硫酸鎂：日本Showa公司產(chǎn)品；C18粉末、活性碳：美國Waters公司產(chǎn)品；Primary secondary amine (PSA)：美國Agilent公司產(chǎn)品；Chlorifiltr：臺灣醫(yī)全公司產(chǎn)品；硅酸鎂：美國Supelco公司產(chǎn)品；超純水：由美國Millipore Simplicity系統(tǒng)制得。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲存溶液的制備

精密稱取1 mg貝母辛、貝母乙素、貝母甲素，用甲醇定容至1 mL，配制成1 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲存溶液，備用。

1.3 貝母樣品的制備

稱取0.5 g均質(zhì)化的貝母樣品于15 mL離心管中，加入3 mL含有3%氨水的乙酸乙酯-水溶液(75∶25，V/V)，再加入1 g碳酸銨，振蕩萃取5 min，以4 000 r/min離心5 min后，取1.8 mL上清液，加入20 mg硅酸鎂和10 mg無水硫酸鎂，以14 000 r/min離心3 min后，氮?dú)獯蹈奢腿∫?，?0%甲醇水溶液定容至 1 mL，待LC-MS/MS分析。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Thermo Scientific Accucore C18柱(150 mm×2.1 mm, 2.6 μm)；流動相：5 mmol/L碳酸氫銨水溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脫：0～1 min(20%B)，1～6 min(20%～40%B)，6～9 min(40%～90%B)，9～16 min(90%B)，16～17 min(20%～40%B)，17～20 min(20%B)；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描模式，噴霧電壓4.6 kV，毛細(xì)管溫度300 ℃，透鏡電壓100 V，鞘氣流速35 arb，輔助氣流速5 arb，質(zhì)量掃描范圍m/z150～500。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的建立

在正離子模式下，分別檢測0.5 mg/L貝母辛、貝母乙素、貝母甲素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，全掃描模式下，基峰離子為質(zhì)子化分子，[M+H]+分別為m/z428、430、432?；咫x子碰撞斷裂可得到子離子掃描質(zhì)譜圖，發(fā)現(xiàn)貝母辛、貝母乙素、貝母甲素的子離子基峰皆為[M+H]+脫去H2O分子得到的[M+H—H2O]+，分別為m/z410、412、414，其中貝母乙素、貝母甲素僅有此碎片離子。為獲得更多的結(jié)構(gòu)信息，本研究采用儀器的Wideband Activation子離子掃描斷裂功能，得到貝母甲素的全掃描子離子質(zhì)譜圖示于圖1?？梢?，貝母甲素產(chǎn)生了[M+H—H2O—CH4]+m/z410斷裂碎片。為了避免最強(qiáng)子離子受其他相同分子質(zhì)量和斷裂途徑相同的噪聲干擾，選擇第二強(qiáng)子離子作為定量離子，貝母辛、貝母乙素、貝母甲素所使用的碰撞能量和子離子斷裂碎片列于表1。

2.2 前處理方法的探討

QuEChERS技術(shù)為Anastassiades等[17]提出的基于溶劑提取和分布式固相萃取技術(shù)所開發(fā)的一種樣品前處理方法，具有快速、簡單、經(jīng)濟(jì)、有效、耐用、安全等特點(diǎn)。本研究采用QuEChERS法萃取貝母樣品中異甾體生物堿的貝母辛、貝母乙素和貝母甲素，并對萃取溶液、吸附劑種類和添加量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。萃取溶液是影響QuEChERS萃取效率的主要因素，實(shí)驗(yàn)分別對QuEChERS法中常用的乙腈及分析中常用的乙酸乙酯作為萃取溶劑的情況進(jìn)行探討。首先，加入不同比例的水，觀察不同萃取溶液對分析物的萃取效率，然后同時加入1%氨水，使分析物達(dá)到分子態(tài)而轉(zhuǎn)移至有機(jī)層，所得結(jié)果示于圖2。可見，乙酸乙酯的溶解度略高于乙腈，加入水可以提高萃取效率，這是因?yàn)樗哂腥芙庑愿?、滲透力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能夠滲入樣品帶出分析物，可以提高傳質(zhì)效率，但加入過多的水反而不利于分析物轉(zhuǎn)移至有機(jī)層，當(dāng)水加入比例超過50%時，萃取效率有下降的趨勢。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇乙酸乙酯-水溶液(75∶25，V/V)作為萃取溶液。

注：a.全掃描質(zhì)譜圖；b.m/z 432子離子掃描質(zhì)譜圖；c.采用Wideband activation功能獲得的m/z 432子離子掃描質(zhì)譜圖圖1 貝母甲素(0.5 mg/L)的電噴霧游離-串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrum of peimine (0.5 mg/L) produced by electrospray ionization-tandem mass spectrometry

異甾體生物堿Isosteroidalalkaloids前體離子Precursorion(m/z)碰撞能量Collisionenergy/eV子離子Production(m/z)貝母辛42832393貝母乙素43045396貝母甲素43245398

在QuEChERS萃取中加入吸附劑進(jìn)行樣品凈化，通過吸附基質(zhì)中的雜質(zhì)以提高信噪聲比。本研究比較了C18、GCB、Chlorofiltr、硅酸鎂和一級二級胺的凈化效果，所得結(jié)果示于圖3。由于異甾體生物堿為類似平面雜環(huán)結(jié)構(gòu)，易與GCB進(jìn)行吸附作用，造成異甾體生物堿信號明顯下降，其他吸附作用也影響信噪比，其中以硅酸鎂作為吸附劑時信噪比最大，因此本研究以硅酸鎂作為優(yōu)化鹽類。QuEChERS前處理技術(shù)萃取松貝中異甾體生物堿的最優(yōu)化條件列于表2。利用優(yōu)化QuEChERS萃取條件和LC-MS/MS分析貝母中貝母辛、貝母乙素、貝母甲素，所得的色譜圖示于圖4。

圖2 不同萃取溶液對貝母辛(20 μg/g)、貝母乙素(40 μg/g)、貝母甲素(40 μg/g)的信號強(qiáng)度影響Fig.2 Effect of extraction solvent on peak areas of peimmisine (20 μg/g), peiminine (40 μg/g), and peimine (40 μg/g)

圖3 不同吸附劑對貝母辛(20 μg/g)、貝母乙素(40 μg/g)、貝母甲素(40 μg/g)的雜質(zhì)凈化效果Fig.3 Effect of sorbent on clean-up efficiency of peimmisine (20 μg/g), peiminine (40 μg/g), and peimine (40 μg/g)

表2 松貝中異甾體生物堿的QuEChERS最優(yōu)化條件Table 2 The optimal QuEChERS conditions for extraction of isosteroidal alkaloids in Fritillaria

2.3 線性關(guān)系

以貝母辛、貝母乙素、貝母甲素的標(biāo)準(zhǔn)儲存溶液，配制成0.1、0.5、2、10、20 μg/g貝母辛，0.05、0.1、0.5、5、10 μg/g貝母乙素與貝母甲素的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，采用優(yōu)化后的QuEChERS和LC-MS/MS條件進(jìn)行測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，異甾體生物堿濃度為橫坐標(biāo)，計算線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)、方法的檢測限和定量限，其結(jié)果列于表3。

2.4 精密度評估

本研究選擇其中一份試樣于同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣3次，考察方法的日內(nèi)精密度；將該份試樣每日進(jìn)樣1次，重復(fù)3天，考察方法的日間精密度。結(jié)果表明：日內(nèi)精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～9.8%，日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.0%～17.5%。

圖4 貝母中貝母辛(20 μg/g)、貝母乙素(40 μg/g)和貝母甲素(40 μg/g)的QuEChERS-LC-MS/MS色譜圖Fig.4 Mass ion chromatograms of peimisine (20 μg/g), peiminine (40 μg/g), and peimine (40 μg/g) produced by QuEChERS-LC-MS/MS

2.5 回收率評估

以貝母辛、貝母乙素、貝母甲素的標(biāo)準(zhǔn)儲存溶液，配制成低(0.1 mg/L貝母辛、0.05 mg/L貝母乙素、0.05 mg/L貝母甲素)、中(2 mg/L貝母辛、0.5 mg/L貝母乙素、0.5 mg/L貝母甲素)、高(20 mg/L貝母辛、10 mg/L貝母乙素、10 mg/L貝母甲素)3種濃度的溶液，進(jìn)行回收率評估。結(jié)果表明：3個分析物在低、中、高濃度時的回收率分別為91.2%～97.0%、 89.6%～93.3%、90.4%～96.8%。

表3 QuEChERS-LC-MS/MS法分析貝母中異甾體生物堿的線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)、定量限和檢測限Table 3 Linear ranges, correlation coefficients (R2), limits of quantification (LOQs) and limits of detection (LODs) for determination of isosteroidal aldaloids in Fritillaria by QuEChERS-LC-MS/MS

2.6 實(shí)際樣品的測定

采用優(yōu)化的QuEChERS-LC-MS/MS方法分析市售爐貝母、西藏貝母、松貝母、川貝母和真貝母中異甾體生物堿含量，不同市售貝母樣品中貝母辛、貝母乙素、貝母甲素的分析結(jié)果列于表4。結(jié)果表明，市售川貝母樣品中貝母辛、貝母乙素和貝母甲素的含量分別為2.86～8.26 μg/g、0.10～1.04 μg/g、0.1～2.68 μg/g。松貝的貝母乙素含量小于檢測限范圍，所以用小于定量限表示。川貝母的萃取離子色譜圖示于圖5，可見，該方法可成功地分析貝母樣品中所含貝母辛、貝母乙素、貝母甲素等異甾體生物堿。

表4 QuEChERS-LC-MS/MS分析市售川貝母樣品中異甾體生物堿含量(μg/g)Table 4 Concentration of isosteroidal alkaloids in commercial Fitillaria products by QuEChERS-LC-MS/MS (μg/g)

注：*表示未檢出

注：a.貝母辛；b.貝母乙素；c.貝母甲素圖5 市售川貝母的萃取離子色譜圖Fig.5 Mass ion chromatograms of commercial Fritillaria product by QuEChERS-LC-MS/MS

3 結(jié)論

本研究采用QuEChERS前處理技術(shù)，結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析貝母樣品中貝母辛、貝母乙素和貝母甲素等異甾體生物堿。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，添加3 mL含有3%氨水的乙酸乙酯-水溶液(75∶25，V/V)于0.5 g貝母樣品中，加入1 g碳酸銨渦流振蕩輔助萃取5 min，以4 000 r/min離心5 min后取上清液，然后加入20 mg硅酸鎂和10 mg無水硫酸鎂進(jìn)行凈化，離心后取上清液，再以氮?dú)獯蹈?，最后?0%甲醇水溶液定容。在優(yōu)化的萃取條件下，貝母樣品中貝母辛的線性范圍為0.1～20 μg/g，貝母乙素和貝母甲素的線性范圍為0.05～10 μg/g，線性相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.992 3，日內(nèi)與日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差介于1.1%～17.5%之間，回收率介于89.6%～97.0%之間。應(yīng)用此方法檢測實(shí)際樣品，測得貝母辛、貝母乙素、貝母甲素的含量分別為4.35、0.92、1.39 μg/g。該方法具有樣品前處理時間短、樣品和有機(jī)溶劑用量少、靈敏度和選擇性高等特點(diǎn)，可應(yīng)用于其他中藥材中特定成分的分析。

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Determination of Isosteroidal Alkaloids inFritillariaspp. by LC-MS/MS

YANG Cheng-ling1, CHANG Hung-chi2, CHEN Chung-yu1, LEE Maw-rong1

(1.DepartmentofChemistry,NationalChungHsingUniversity,Taichung402,China;2.DepartmentofGolden-AgerIndustryManagement,ChaoyangUniversityofTechnology,Taichung413,China)

Bulbus Fritillaria (BF), one of the derivatives from the plant of variousFritillariaspecies, has been commonly used as expectorant and antitussive herb in traditional Chinese medicine. The value of BF is relative related to its quality, however, there is no reliable method to evaluate its quality. Therefore, it is necessary to develop a rapid and reliable method for classification of species of BF. In this study, the QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe) as sample preparation method and combined with liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was proposed to determine trace alkaloids of BF. The main bioactive isosteroidal alkaloids analyzed are peimine, peiminine and peimisine. The extraction efficiency of QuEChERS were systematically studied and the optimal extraction conditions were as follows: extraction of three alkaloids by using 3 mL extraction solution of ethyl acetate-water (75∶25,V/V) which is containing 3% ammonium hydroxide and 1 g of ammonium carbonate, and then mixing by vortex condition for 5 min. The extract was cleaned with 10 mg of anhydrous magnesium sulfate and 20 mg of florisil. The extracted isosteroidal alkaloids were analyzed by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The quantification was performed by extracted ion chromatography and MS/MS spectra was applied for identification of isosteroidal alkaloids. The linear range for peimisine is from 0.1 to 20 μg/g and for peiminine and peimine are from 0.05 to 10 μg/g with coefficients of determination (R2) above 0.992 3. The limit of detection (LODs) of the proposed method range from 0.005 to 0.03 μg/g. Intra-day and inter-day precisions represented in RSD% are in a range of 1.1%-17.5%. The recoveries are in a range of 89.6%-97.0%. The amount of peimisine, peiminine, peimine in a real Chuan-Beimu sample were detected by the proposed method and the amount are at 4.35, 0.92, 1.39 μg/g, respectively.

Bulbus Fritillaria; isosteroidal alkaloids; QuEChERS; liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)

2016-03-04;

2016-03-27

楊宬苓(1991—)，女(漢族)，臺灣人，碩士研究生，從事質(zhì)譜分析研究。E-mail: u9812039@ems.ndhu.edu.tw

李茂榮(1953—)，男(漢族)，臺灣人，教授，從事食品、環(huán)境、中草藥分析研究。E-mail: mrlee@dragon.nchu.edu.tw

O657.63

A

1004-2997(2017)01-0011-08

10.7538/zpxb.2017.38.01.0011