戴雨霖，龐 博，閻 琪，喬夢丹，鄭 飛，越 皓，劉淑瑩

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長春 130023)

黃泥煨制人參中皂苷成分的RRLC-Q-TOF MS分析

戴雨霖1，龐 博2，閻 琪1，喬夢丹1，鄭 飛1，越 皓1，劉淑瑩1

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長春 130023)

人參作為新資源食品，有多種炮制方法的應(yīng)用。本研究對于黃泥煨制的人參化學(xué)成分是否安全、可靠提供了借鑒。利用高分離度快速液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(RRLC-Q-TOF MS)法研究黃泥煨炮制方法的人參化學(xué)成分。鮮人參黃泥煨制的樣品溶解離心過濾后，采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱，以0.1%甲酸水-乙腈溶液作為流動相進行梯度洗脫，高分辨質(zhì)譜進行檢測，Masshunter Qualitative Analysis軟件與人工相結(jié)合進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明，本研究鑒定了31種人參皂苷，比較了黃泥煨制人參與其他炮制方法人參中人參皂苷的相對百分含量差異，同時檢測到F2、Rg3等稀有人參皂苷。該研究可為人參的使用提供更多的途徑，能夠為開發(fā)人參的多種保健功能提供依據(jù)。

黃泥煨制；人參皂苷；液相色譜-質(zhì)譜

人參是五加科植物人參(PanaxginsengC.A. Mey.)的干燥根，其主要有效成分是人參皂苷[1]。人參皂苷屬于三萜類化合物，可分為原人參二醇型皂苷(Protopanaxadiol, PPD)、原人參三醇型皂苷(Protopanaxatriol, PPT)和齊墩果烷型人參皂苷(Oleanolic acid)3類；按照C-20位結(jié)構(gòu)的不同，又可以分為20(S)-和20(R)-型人參皂苷，其中天然人參皂苷均為20(S)-構(gòu)型。2012年，國家衛(wèi)生部發(fā)布了關(guān)于批準人參為新資源食品的公告，因此其有了更多的食用途徑和方法。人參主要有紅參、生曬參、大力參等炮制品[2-4]，古代醫(yī)書《普濟方》中還有用黃泥煨制藥材的記載[5]，此方法在國內(nèi)一些地區(qū)仍然沿用。有研究表明，人參經(jīng)過加工炮制后，所含的有效成分會發(fā)生復(fù)雜的變化，同時伴有新物質(zhì)生成[6]。黃泥煨制方法中，高溫加熱且隔絕空氣的條件是否影響人參的有效成分和含量至今鮮有報道。

高分離度快速液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(RRLC-Q-TOF MS)技術(shù)常被用于天然產(chǎn)物的化學(xué)成分分析[7-8]，如，Wang等[9]利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測了人參和西洋參中人參皂苷類化合物的差異。為了比較黃泥煨制方法炮制的人參與其他方法制得的炮制品之間化學(xué)成分的差異，本實驗用黃泥包裹人參，在高溫烘箱中加熱后，制得黃泥煨人參樣品。采用RRLC-Q-TOF MS聯(lián)用技術(shù)對3種人參炮制品(生曬參、黃泥煨人參及醋制參)的化學(xué)成分進行分析，希望為人參的藥效學(xué)研究提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與材料

Agilent 1200型快速分離液相色譜系統(tǒng)，Agilent 6520 Q-TOF 質(zhì)譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品。

鮮人參、生曬參：5年參，購于吉林省撫松縣萬良人參市場，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定為五加科植物人參PanaxginsengC.A. Mey.的根；人參皂苷Rg2、Rg3、Rb1、Rc、Rd、Re和Rf等對照品(純度均大于98%)：南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.2 樣品的制備

鮮人參按照2015版藥典的炮制方法制成生曬參，備用。

黃泥煨炮制方法(mud-covered processed method, MPM)：用黃泥完全包裹鮮人參，于80 ℃高壓烘箱中加熱2.5 h后，冷卻至室溫，剝?nèi)S泥，備用。

醋制人參炮制方法：用市售食醋浸泡鮮人參48 h后，于100 ℃高壓蒸鍋蒸制2.5 h，冷卻至室溫后，置于60 ℃干燥烘箱中干燥72 h，備用。

取1 g炮制后的人參粉末，加入20 mL 70%甲醇，浸泡過夜，超聲60 min，以5 000 r/min離心10 min，過0.22 μm濾膜，備用。

1.3 實驗條件

1.3.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18 色譜柱(2.1 mm×100 mm×3.5 μm)；流動相：0.1%甲酸水溶液(A)，乙腈(B)；梯度洗脫程序：0～2 min(0%～10%B)，2～7 min(10%～15%B)，7～15 min(15%～30%B)，15～21 min(30%～39%B)，21～33 min(39%～50%B)，33～44 min(50%～68%B)，44～50 min(68%～100%B)；柱溫35 ℃；流速 0.3 mL/min；進樣量5 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，負離子掃描模式(ESI-)；干燥氣(N2)流速9 L/min，干燥氣溫度300 ℃；霧化氣壓力2.41×105Pa；毛細管電壓3.5 kV；碎裂電壓175 V；錐孔電壓65 V；質(zhì)量掃描范圍m/z100～2 000。實驗數(shù)據(jù)采用Masshunter Qualitative Analysis(B.03.01)軟件分析處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性范圍和檢出限

選擇人參中的主要成分人參皂苷Rg2和Rf作為對照品，按照1.3節(jié)條件分析，并計算方法的線性范圍和檢出限，結(jié)果列于表1。以樣品的濃度(mg/L)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結(jié)果表明，在0.025～2.5 mg/L濃度范圍內(nèi)，Rg2對照品的相關(guān)系數(shù)為0.994，線性關(guān)系良好；在0.1～10 mg/L濃度范圍內(nèi)，Rf對照品的相關(guān)系數(shù)為0.995，線性關(guān)系良好。以3倍信噪比(S/N=3)計算2種對照品的檢出限(LODs)，Rg2對照品的檢出限為0.001 mg/kg，Rf對照品的檢出限為0.001 2 mg/kg。

2.2 不同炮制品化學(xué)成分的分析及比較

人參皂苷在ESI-模式下的一級質(zhì)譜圖中，準分子離子主要以[M-H]-和[M+HCOOH-H]-形式存在[10]。通過RRLC-Q-TOF MS技術(shù)可獲得標準對照品的質(zhì)譜信息和供試品一級譜中的分子質(zhì)量信息，然后通過二級串聯(lián)質(zhì)譜分析得到碎片信息，并確定苷元類型和所連糖基的種類和數(shù)量，從而確定人參皂苷的結(jié)構(gòu)。實驗數(shù)據(jù)采用提取離子流(EIC)方法分析。

表1 對照品人參皂苷Rg2和Rf的線性范圍、回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 1 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r2) and limitsof detection (LODs) of ginsenosides Rg2 and Rf

以丙二酰基人參皂苷mRb1為例說明人參皂苷的鑒定方法。人參皂苷mRb1是二醇型人參皂苷，其C-3位取代基是一分子丙二?；蛢煞肿悠咸烟切纬傻膫?cè)鏈，C-20位為兩分子葡萄糖連接而成，其二級串聯(lián)質(zhì)譜圖示于圖1。mRb1理論分子質(zhì)量為1 194.603 3，在一級質(zhì)譜圖中主要以[M-H]-離子形式存在，[M-H]-理論值為1 193.596 1，測得值為1 193.596 7，誤差為0.5×10-6。m/z1 193離子脫去丙二?；?86 u)產(chǎn)生m/z1 107 [M-malonyl-H]-特征碎片離子；脫去丙二?；鸵环肿悠咸烟切纬蒻/z945離子；繼續(xù)脫去一分子葡萄糖殘基分別產(chǎn)生m/z783、621、459碎片離子，其中碎片離子m/z459 是二醇型人參皂苷的特征離子。這與文獻[4]報道的一致，由此推斷該物質(zhì)為人參皂苷mRb1。用同樣的方法可以判定所測得的其他人參皂苷的RRLC-MS/MS數(shù)據(jù)，結(jié)果列于表2。

圖1 人參皂苷mRb1二級串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.1 MS/MS spectrum of mRb1 ginsenoside

序號No.化合物Ginsenosides分子式MoleculaformulaWMPM[M-H]-/[M+HCOOH-H]-(m/z)※串聯(lián)質(zhì)譜碎片MS/MSfragmention(m/z)1Ra0C60H102O28-+1269.6485/1315.6541107,945,783,621,4592Ra1C58H98O26+++1209.6274/1255.63281107,945,783,621,4593Ra2C58H98O26+++1209.6274/1255.63281107,945,783,621,4594Ra3C59H100O27+++1239.6379/1285.64341107,1077,945,783,621,4595Rb1C54H92O23+++++1107.5957/1153.6011945,783,621,4596Rb2C53H90O22++++1077.5851/1123.5906945,783,621,4597Rb3C53H90O22++++++1077.5851/1123.5906945,783,621,4598RcC53H90O22++++1077.5851/1123.5906945,783,621,4599RdC48H82O18+++945.5428/991.5483783,621,45910Rg3C42H72O13+++783.49/829.4955621,45911Rs1C55H92O23+++1119.5957/1165.60111077,1059,945,783,621,45912Rs2C55H92O23+++1119.5957/1165.60111077,1059,945,783,621,45913Rs3C44H74O14-++825.5006/871.5061783,621,45914mRb1C57H94O26+++1193.5961/—1107,945,783,621,45915mRb2C56H92O25++++1163.5855/—1077,915,783,621,45916mRb3C56H92O25++++1163.5855/—1077,915,783,621,45917mRcC56H92O25++++1163.5855/—1077,915,783,621,45918mRdC51H84O21++++1031.5432/—945,783,765,621,45919F2C42H72O13-+783.49/829.4955621,45920Rg1C42H72O14++++++—/845.4904637,47521RfC42H72O14++++++799.4849/845.4904637,47522Rg2C42H72O13+++783.49/829.4955637,47523ReC48H82O18+++945.5428/—799,783,637,47524NotoR1C47H80O18+++931.5272/977.5327799,637,47525NotoR2C41H70O13+++769.4744/815.4798637,47526mRg1C45H74O17++++885.4853/—781,637,47527mRfC45H74O17++++885.4853/—781,619,47528mReC51H84O21++1031.5432/—945,799,637,4752920-Glc-RfC48H82O19++961.5378/1007.5432799,637,47530F3C41H70O13-+769.4744/—637,47531RoC48H76O19++++955.4908/—793,613,569,453

注：1.W=生曬參；MPM=黃泥煨人參；2.編號1～19為二醇型人參皂苷，編號20～30為三醇型人參皂苷，編號31為齊墩果烷型人參皂苷；3.“-”代表未檢測到，“+”代表峰面積為(0～2)×105，“++”代表峰面積為(2～5)×105，“+++” 代表峰面積大于5×105；4.“※”表示質(zhì)量準確度<10-5

黃泥煨人參和醋制人參中的原人參二醇型人參皂苷轉(zhuǎn)化途徑示于圖2。由于生曬參在炮制過程中未經(jīng)高溫蒸制，因此其皂苷類成分中存在天然的丙二?；惾藚⒃碥?；而黃泥煨制過程中會有一部分丙二?；惾藚⒃碥战?jīng)高溫水解脫去丙二?；?，生成了相應(yīng)的人參皂苷，如mRe經(jīng)水解生成了Re，因此黃泥煨炮制品中類似Re的人參皂苷含量會明顯偏高，另外，黃泥煨制人參中還存在一些生曬參中沒有檢測出的成分。

2.3 炮制品中原人參二醇型人參皂苷轉(zhuǎn)化途徑

在人參的炮制品中，原人參二醇型人參皂苷含量相對豐富。與本課題組之前研究的醋制人參[11]中原人參二醇型人參皂苷含量及轉(zhuǎn)化途徑相比，醋制人參的炮制效果更“劇烈”，黃泥煨制的炮制效果更“柔和”。兩種炮制品皂苷轉(zhuǎn)化均有以下過程：人參皂苷Rb1(1 108)、Rb2(1 078)、Rb3(1 078)、Rc(1 078) 的C-3和C-20位分別連有不同的糖基，如人參皂苷Rb3在RRLC-Q-TOF MS一級譜圖中的準分子離子為[M-H]-(m/z1 077.585 1)。在ESI-MS/MS 條件下發(fā)生碎裂產(chǎn)生一系列碎片離子，其中m/z945是m/z1 077離子失去C-20位木糖基C5H8O4(132 u)碎片產(chǎn)生的；m/z783是m/z1 077 離子失去C-20位木糖基碎片并且失去一個葡萄糖基C6H10O5碎片產(chǎn)生的；m/z621是m/z1 077離子失去C-20位木糖基碎片且分別失去兩個葡萄糖基C12H20O10碎片產(chǎn)生的；m/z459是m/z1 077離子失去C-20位和C-3位所有取代糖基碎片產(chǎn)生的。炮制過程中，人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc會發(fā)生C-20位的取代基優(yōu)先失去，C-3位保持不變，即轉(zhuǎn)化成人參皂苷Rd(946)。繼續(xù)轉(zhuǎn)化會有兩條途徑：第一條途徑是人參皂苷失去C-3位的葡萄糖基C6H10O5(162 u)和C-20位的一個糖基，產(chǎn)生人參皂苷F2。第二條途徑是人參皂苷失去C-20位的糖基并且C-3位的取代基不變，即轉(zhuǎn)化成C-20位R/S構(gòu)型的Rg3，提取離子流圖示于圖3。除了以上轉(zhuǎn)化途徑，醋制人參還可以沿著第一條途徑F2接著失去C-3位或者C-20位的糖基后，分別轉(zhuǎn)化成人參皂苷CK和Rh2(圖2)。沿著第二條途徑Rg3接著失去C-3位的一個葡萄糖基，轉(zhuǎn)化成人參皂苷Rh2。最后Rg3經(jīng)過水合作用或者脫水作用分別可以生成人參皂苷CY和人參皂苷Rk1/Rg5。而在黃泥煨制人參樣品中，未檢測到以上稀有人參皂苷的質(zhì)譜信號。

注：細線代表醋制人參轉(zhuǎn)化線路，粗線代表黃泥煨制人參轉(zhuǎn)化線路圖2 黃泥煨人參和醋制人參中的原人參二醇型人參皂苷轉(zhuǎn)化途徑圖Fig.2 Comparation between vinegar and mud-covered processed ginseng in chemical transformation pathway for PPD-type ginsenosides

圖3 黃泥煨制人參的提取離子流圖(m/z 783.490 0)Fig.3 Extract ion chromatography (EIC) of mud-covered processed ginseng at m/z 783.490 0

3 結(jié)論

實驗通過RRLC-Q-TOF MS聯(lián)用技術(shù)比較了生曬參、黃泥煨人參及醋制人參的皂苷類成分。研究表明，在生曬參中能檢測出的人參皂苷在人參的幾種炮制品中都能檢測出來，黃泥煨制人參有部分人參皂苷能夠轉(zhuǎn)化成稀有人參皂苷，如Rg3、F2等。但與其他炮制方法比較，仍有一些皂苷轉(zhuǎn)化不能繼續(xù)進行，有文獻報道[12]，加熱對中藥有效成分的影響較大。黃泥煨制人參較其他人參炮制品更加“柔和”，皂苷含量及種類介于生曬參和醋制人參之間，提示酸堿度可能影響人參皂苷成分的轉(zhuǎn)化。本研究可為今后人參保健食品的多元化開發(fā)提供一種選擇，同時提出了黃泥煨制人參的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

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Study on Ginsenosides in Mud-Covered Processed-Ginseng by RRLC-Q-TOF MS/MS

DAI Yu-lin1, PANG Bo2, YAN Qi1, QIAO Meng-dan1, ZHENG Fei1, YUE Hao1, LIU Shu-ying1

(1.ChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun130117,China;2.FirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130023,China)

PanaxginsengC. A. Mey (ginseng) is a traditional Chinese medicine herb, which has been widely used for the treatment of enhancing intelligence and improving immunity in China and Aisa. As a new resource food in China, ginseng has a variety of processing methods which are used for different symptoms. The major active components of ginseng are ginsenosides, which demonstrate the ability to target a number of tissues and produce an array of pharmacological responses. In this study, active components from mud-covered processed-ginseng were studied whether the chemical composition of ginseng is safety and reliable. Rapid resolution liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight tandem mass spectrometry (RRLC-Q-TOF MS/MS) was used to compare the white ginseng, vinegar processed ginseng and mud-covered processed ginseng for the composition of ginsenosides. Chromatographic conditions were as follows: ZORBAX SB-C18 column (2.1 mm×100 mm×3.5 μm), column temperature of 35 ℃, mobile phase of water-acetonitrile gradient elution, flow rate of 0.3 mL/min, injection volume of 5 μL. Thirty-one ginsenosides were identified by the comparison of the retention times of the standard compounds and the accurate mass obtained from RRLC-Q-TOF MS/MS. A few minor ginsenosides, such as ginsenoside F2and Rg3, were detected by the comparison of white ginseng with processed-ginseng. The method is applicable to the research of compounds in the processed Chinese herbs.

mud-covered processed ; ginsenosides; liquid chromatography-mass spectrometry

2016-06-07;

2016-09-05

國家自然科學(xué)基金項目(31400682)；吉林省科技發(fā)展計劃項目(20160101152JC)資助

戴雨霖(1988—)，男(漢族)，吉林人，研究實習(xí)員，從事中藥有效成分分析。E-mail: dyltcm@163.com

越 皓(1977—)，男(漢族)，吉林人，研究員，從事中藥化學(xué)和色譜質(zhì)譜研究。E-mail: jlsrskxyjy@126.com

劉淑瑩(1943—)，女(漢族)，黑龍江人，研究員，從事中藥化學(xué)和有機質(zhì)譜學(xué)研究。E-mail: syliu@ciac.jl.cn

O657.63

A

1004-2997(2017)01-0060-07

10.7538/zpxb.2017.38.01.0060