陳東曉，張娟梅，李建業(yè)，徐天宏，董亞琴，蒲曉輝

1.河南大學 藥學院，河南 開封，475004； 2. 南京拉克森生物醫(yī)藥科技有限公司，南京，211100

紫杉醇(paclitaxel)是從紅豆杉科紅豆杉屬(Taxus)植物的樹皮中提取得到的二萜類化合物。純品紫杉醇為白色結(jié)晶粉末，分子式為C47H51NO14，相對分子質(zhì)量為853.92，具有高度的親脂性，易溶于氯仿、乙醇等有機溶劑，難溶于水[1]。經(jīng)臨床驗證，紫杉醇具有良好的抗腫瘤作用，特別是對癌癥發(fā)病率較高的卵巢癌、子宮癌和乳腺癌等有特效，被認為是人類未來20年間最有效的抗癌藥物之一。但紫杉醇難溶于水的性質(zhì)嚴重阻礙了其在臨床治療中的應(yīng)用。為了解決其在靜脈注射中的難題，人們不得不在注射劑中加入表面活性劑聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL，Cr EL)。目前在臨床最為常用的Taxol為6 mg/mL 的紫杉醇混合于Cremophore EL及無水乙醇(1∶1)媒介中。市售的紫杉醇注射液Taxol由于含有大量的表面活性劑Cr EL，毒性很大，進入體內(nèi)容易發(fā)生溶血，出現(xiàn)嚴重的過敏反應(yīng)[2]。

白蛋白納米粒是以白蛋白為基質(zhì)的納米級微粒。白蛋白屬于內(nèi)源性天然產(chǎn)物，具有安全無毒、無免疫原性、可生物降解、生物相容性好等優(yōu)點。而且納米粒載體系統(tǒng)又具備獨特的靶向性、緩控釋特性和保護藥物作用[3]。因此，將白蛋白納米粒運用于紫杉醇的體內(nèi)傳遞與癌癥治療已成為近年來研究的熱點。通過將內(nèi)源性白蛋白與紫杉醇的結(jié)合，所制得的納米粒子不僅克服了紫杉醇難溶于水的缺點，也避免了使用Cr EL和吐溫80等輔料帶來的毒副作用。同時，其載藥量顯著高于Taxol，且具有一定的緩釋效果，具備更好的抗腫瘤療效。目前，已經(jīng)上市并臨床用于乳腺癌治療的紫杉醇白蛋白混懸液(Abraxane)，以其良好的生物相容性，可生物降解、無免疫原性，以及更好的抗腫瘤效果，為臨床上癌癥的控制與治療提供了有效的解決方案。

我們主要通過對紫杉醇白蛋白納米粒子的制備工藝、作用機制、靶向修飾以及臨床應(yīng)用等方面的分析與比較，概括總結(jié)紫杉醇白蛋白納米粒的研究現(xiàn)狀與進展，為研究者們下一步的研究提供一定的理論與經(jīng)驗基礎(chǔ)。

1 作用機制

1.1 紫杉醇的抗腫瘤機制

紫杉醇主要作用于微管蛋白。微管蛋白是所有真核細胞中構(gòu)成細胞骨架的成分，也是細胞分裂過程中組成紡錘體的重要成分。紫杉醇通過誘導(dǎo)和穩(wěn)定微管蛋白聚合并抑制其正常的生理性解聚，使細胞中微管蛋白含量增多。在細胞分裂過程中，微管蛋白的增多會導(dǎo)致紡錘體微管的減少，紡錘絲與紡錘體無法形成，從而使癌癥細胞的分裂永遠停留在G2和M期，導(dǎo)致其無法復(fù)制，最終使其凋亡[4]。

1.2 白蛋白納米粒的內(nèi)吞機制

對于白蛋白納米粒的內(nèi)吞機制，目前的研究結(jié)果大多認為分為兩個階段：首先，白蛋白納米粒被注入到人體后，經(jīng)血液循環(huán)到達腫瘤部位，一部分經(jīng)EPR效應(yīng)流入腫瘤組織，大多數(shù)是利用白蛋白激活內(nèi)皮細胞表面的gp-60受體，使內(nèi)皮細胞凹陷成窩從而將納米粒轉(zhuǎn)運至腫瘤細胞間隙[5]。然后，細胞間隙的白蛋白納米粒進一步由SPARC(富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白)介導(dǎo)進入腫瘤細胞，實現(xiàn)腫瘤細胞的內(nèi)吞，藥物在腫瘤細胞內(nèi)被釋放，從而起到抗腫瘤療效[6]。

2 白蛋白納米粒的制備方法

經(jīng)研究，藥物與白蛋白之間的結(jié)合以靜電作用和疏水作用為主。制備的方法一般有去溶劑化法、pH凝聚法、快速膨脹超臨界溶液法、機械研磨法、基于二硫鍵形成法的 nabTM技術(shù)以及熱凝膠化法。

2.1 去溶劑化法

通過脫水劑的去溶劑化作用除去白蛋白的水化膜，使白蛋白析出，輔以攪拌，再用交聯(lián)劑與白蛋白發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)使之變性，從而穩(wěn)定白蛋白納米粒，然后純化除去殘留的交聯(lián)劑和有機溶劑。其中，交聯(lián)劑多采用戊二醛，脫水劑多用乙醇或丙酮等。采用丙酮為脫水劑的固化溫度低、 時間短，可用于包埋溫度敏感的藥物[7]。

2.2 pH凝聚法

在制備白蛋白納米粒子的過程中，改變白蛋白溶液的pH值、濃度以及交聯(lián)劑的用量，來制備得到形態(tài)均一、粒徑穩(wěn)定的白蛋白納米粒子。Merodio等曾對其制備方法進行過對比，發(fā)現(xiàn)以pH凝聚法制得的白蛋白納米粒具有更好的控釋效果[8]。

2.3 快速膨脹超臨界溶液法

Meziani等于2003年報道了將生物材料與無機物偶聯(lián)形成蛋白納米粒的方法：快速膨脹超臨界溶液法，并制備得到了硫化銀-BSA納米粒。該法主要是以超臨界流體(如CO2)為溶劑，將模型藥物溶于其中。施加壓力并通過小孔后其溶液快速膨脹，溶劑揮發(fā)，溶質(zhì)迅速噴入到白蛋白溶液當中即制得相應(yīng)的載藥白蛋白納米粒子。之后經(jīng)過離心、沉淀等手段可以分離得到較純凈的納米粒子。其中，膨脹壓力、加熱溫度以及噴嘴孔徑的大小對粒子的粒徑及分布影響較大，可以對其進行適當調(diào)整來滿足實驗要求[9]。

2.4 機械研磨法

何治柯等發(fā)明了制備水溶性CdSe/ZnS白蛋白納米粒的方法，將分散于正己烷中ZnS 包覆的CdSe 核殼型量子點用甲醇沉淀、洗滌、干燥后再分散于正己烷溶液，將牛血清白蛋白與量子點的正己烷溶液一起放入研缽，適度研磨混勻，待正己烷揮發(fā)后加入PBS緩沖液洗滌再分散，讓白蛋白與納米粒進一步作用后，離心上層液即為白蛋白包裹的CdSe/ZnS納米粒[10]。

2.5 基于二硫鍵形成法的NabTM技術(shù)

該法主要利用了白蛋白帶有巰基或二硫鍵基團。首先，分別將難溶性藥物與白蛋白溶于有機相與水相中，將二者混合。然后，在高剪切力下，液體內(nèi)產(chǎn)生氣穴空化作用，引起局部高熱，使得白蛋白中巰基或二硫鍵斷裂，同時有機溶劑快速揮發(fā)，并在白蛋白內(nèi)/間交聯(lián)形成新的二硫鍵，從而在非水性介質(zhì)微小液滴(如水不溶性藥物)的周圍形成一個交聯(lián)的聚合物殼體。該法制備得到的納米粒子生物相容性好，可生物降解，并且其粒徑分布較小，避免了高壓滅菌帶來的蛋白質(zhì)變性問題。但該法中使用了氯仿等毒性較大的有機溶劑，而且其制備周期及操作要求較高，不利于大規(guī)模機械化生產(chǎn)[11]。

2.6 熱凝膠化法

熱凝膠化法是利用白蛋白受熱凝膠化而自發(fā)形成納米粒子的方法。相較于上述幾種方法，該法在制備過程中未引入任何有機溶劑，避免了有機溶劑未完全除去的安全隱患。另外，該法操作簡單，對儀器設(shè)備要求較低，因此成本較低，有利于其在臨床上的廣泛應(yīng)用[12]。

3 白蛋白納米粒子的表面修飾策略

白蛋白納米粒子多以物理包埋的方式制備得到。該類方式制備得到的納米粒子不僅能夠保護藥物不受外界環(huán)境因素的影響，還能夠提高藥物的穩(wěn)定性。另外，通過調(diào)整工藝中的投料比、改變溫度及反應(yīng)時長等因素，可以有效地控制制得的納米粒子的粒度大小，從而使其能夠依賴EPR效應(yīng)達到腫瘤靶向的目的。由于白蛋白表面具有很多的活性氨基，應(yīng)用白蛋白表面活性基團與藥物偶聯(lián)，吸收進入體內(nèi)后，連接的化學鍵在體內(nèi)酶的作用下斷裂，即可實現(xiàn)提高藥物溶解性、緩釋以及靶向的目的。常見的針對氨基的修飾有以下幾種。

3.1 PEG修飾

將適宜分子量的PEG共價結(jié)合到白蛋白的活性氨基上，從而提高其親水性，以避開巨噬細胞的吞噬作用。有研究者對多西紫杉醇白蛋白納米粒作了PEG修飾，目的是避開肝臟的巨噬細胞，從而使其轉(zhuǎn)運至肺組織發(fā)揮抗腫瘤效果。從實驗結(jié)果可以看出，相比于未經(jīng)修飾的納米粒，PEG化的白蛋白納米粒表現(xiàn)出更強的緩釋效果以及更長的體內(nèi)滯留時間[13]。

3.2 疏水性修飾

對白蛋白氨基進行疏水性修飾，使其具有兩親性，進而向納米膠束方向轉(zhuǎn)變。烷基化后形成的白蛋白納米膠束具有更小的粒徑范圍，提高了制劑的被動腫瘤靶向能力。但實驗結(jié)果證明，烷基化的疏水鏈長度應(yīng)加以控制，否則打破兩親性平衡后易出現(xiàn)納米膠束的聚沉[14]。

3.3 結(jié)合細胞特異性受體信號

結(jié)合細胞特異性受體，例如將氨基半乳糖化，使其能被肝癌細胞特異性識別，從而使其具有一定的肝靶向能力[15]。

3.4 葉酸修飾

針對腫瘤組織處細胞表面豐富的葉酸受體這一特性，對氨基進行葉酸修飾，可提高載藥白蛋白納米粒子的腫瘤靶向能力。張良珂等人對以葉酸偶聯(lián)修飾得到的牛血清白蛋白納米粒進行了腫瘤靶向性研究。首先，在堿性條件下使葉酸活性酯與牛血清白蛋白納米粒偶聯(lián)得到目的產(chǎn)物，然后以熒光定量法實時監(jiān)測腫瘤細胞對其的攝取情況。結(jié)果顯示，葉酸修飾得到的白蛋白納米粒在腫瘤細胞攝取量與其濃度和培養(yǎng)時間成正比，該攝取活動在高濃度葉酸環(huán)境中可以被抑制[16]。

3.5 抗體-抗原介導(dǎo)

采用抗體-抗原介導(dǎo)系統(tǒng)，對白蛋白表面活性氨基做免疫抗體偶聯(lián)修飾，實現(xiàn)其特異性免疫介導(dǎo)的靶向給藥目的。劉婭妮等人設(shè)計并制備得到了VCAM-1單克隆抗體修飾的白蛋白微氣泡，并用其培養(yǎng)損傷細胞(細胞表面VCAM-1抗原高度表達)和正常細胞。最終結(jié)果表明，抗體修飾后的白蛋白納米粒大量聚集于損傷細胞周圍，而正常細胞無此現(xiàn)象。這證明了抗體-抗原介導(dǎo)的白蛋白給藥系統(tǒng)具有更加優(yōu)異的靶向能力[17]。

3.6 磁靶向修飾

信濤等人曾以去溶劑法制備得到了阿霉素白蛋白磁性納米粒子，并以肝癌小鼠為模型，以外加磁場與栓塞供血動脈為動力，考察了其在動物體內(nèi)的組織學分布。結(jié)果顯示，磁性納米粒具有更好的腫瘤集聚能力，且聯(lián)合給藥使得進入血液循環(huán)的藥物減少，從而降低了阿霉素的毒副作用[18]。

4 紫杉醇白蛋白納米粒的臨床應(yīng)用

用于臨床上治療腫瘤的傳統(tǒng)紫杉醇注射劑，在溶解時使用了表面活性劑聚氧乙烯蓖麻油。因聚氧乙烯蓖麻油可使肥大細胞脫顆粒，釋放組胺引起過敏反應(yīng)，發(fā)生率高達25%～30%，嚴重者可致人死亡[19]。所以，該劑型具有嚴重的毒副作用，在臨床使用前必須進行抗過敏藥物與糖皮質(zhì)激素的處理。而紫杉醇白蛋白納米粒子的制備不涉及合成材料，也并未使用聚氧乙烯蓖麻油等毒副作用較強的增溶劑，因此在臨床使用前無需進行相關(guān)的預(yù)處理。另外，白蛋白納米粒的內(nèi)吞機制也使其在相同濃度下表現(xiàn)出比傳統(tǒng)注射劑更強的抗腫瘤效果，使用紫杉醇白蛋白納米粒在較低濃度下即可達到相應(yīng)的治療效果。這就可以有效地避免紫杉醇在高濃度下誘導(dǎo)產(chǎn)生的周圍感覺神經(jīng)病變[20]。

目前，已上市使用的紫杉醇白蛋白納米?；鞈覄┍谎芯孔C明在卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、胰腺癌以及前列腺癌等癌癥的治療過程中均具有一定的療效。

2015年，江浩等人設(shè)計并進行了白蛋白結(jié)合型紫杉醇與傳統(tǒng)注射型紫杉醇在卵巢癌治療上的療效對比實驗。該實驗以小鼠構(gòu)建卵巢癌模型，通過比較在相同的毒性劑量下小鼠的死亡率以及腫瘤增長速率來證實白蛋白結(jié)合型紫杉醇的用藥安全性。結(jié)果顯示，給藥白蛋白組小鼠的存活率與腫瘤抑制率顯著高于紫杉醇注射劑組。另外，臨床研究表明白蛋白結(jié)合型紫杉醇對復(fù)發(fā)型卵巢癌具有明顯的療效[21]。

2010年，李蘇等人對24例乳腺癌患者進行了白蛋白納米紫杉醇與傳統(tǒng)溶劑型紫杉醇的療效以及藥代動力學對比。結(jié)果顯示，相比于傳統(tǒng)劑型，白蛋白納米在進入人體后15 min即達峰濃度，且最高血藥濃度是傳統(tǒng)劑型的2～3倍。同時，二者治療組均出現(xiàn)Ⅰ～Ⅲ血液學毒性，但比例為1∶2.5(白蛋白納米與傳統(tǒng)溶劑型)[22]。

在非小細胞肺癌的治療上，目前多采用聯(lián)合治療的方案，即將白蛋白結(jié)合型紫杉醇與卡鉑、培美曲塞、厄洛替尼等藥物聯(lián)用[23-25]。此法不僅能夠顯著提高對非小細胞肺癌的治療作用，而且由化療藥物引起的毒副作用也明顯減緩。其中，白蛋白結(jié)合型紫杉醇聯(lián)合卡鉑已于2012年被FDA批準用于非小細胞肺癌的一線治療。而培美曲塞與厄洛替尼作為二線治療藥物與白蛋白結(jié)合型紫杉醇聯(lián)用也表現(xiàn)出提高的治療效果。

此外，紫杉醇對于胰腺癌與前列腺癌也有一定的治療效果[26]。DD Von Hoff等在研究白蛋白結(jié)合型紫杉醇聯(lián)合吉西他濱用于治療胰腺癌的Ⅰ/Ⅱ期臨床實驗中發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療前后的有效率分別為17%與57%。另外，紫杉醇在治療過程中副作用(如粒細胞減少、血小板減少及感覺神經(jīng)毒性)的發(fā)生率也呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢。T Kolevska等針對轉(zhuǎn)移性前列腺癌做了白蛋白結(jié)合型紫杉醇的Ⅱ期臨床研究。結(jié)果表明，該制劑用于治療激素抵抗的轉(zhuǎn)移性前列腺癌的臨床收益率在68%以上，且不良反應(yīng)可以耐受[27]。

5 總結(jié)

納米粒子以其微小的粒徑分布，能夠比較容易地通過EPR效應(yīng)富集于腫瘤部位，從而實現(xiàn)抗腫瘤藥物的被動靶向治療。而將內(nèi)源性白蛋白用于構(gòu)建納米載藥傳遞系統(tǒng)，不僅能夠大大提高化療藥物的血藥濃度，還可以利用白蛋白本身的親和性避免機體自身的吞噬機制。通過腫瘤細胞膜表面特異性表達的受體以及腫瘤組織微環(huán)境的特異性，對白蛋白活性氨基進行適當?shù)男揎?，更能實現(xiàn)抗腫瘤藥物的主動靶向治療。目前已上市使用的注射用白蛋白結(jié)合型紫杉醇混懸劑，不僅大大提高了抗癌藥物的腫瘤靶向作用，還顯著減少了傳統(tǒng)劑型中使用輔料以及高濃度下化療藥物本身所產(chǎn)生的毒副作用。多個地區(qū)及國家的臨床治療結(jié)果也顯示出其相比于傳統(tǒng)溶劑型紫杉醇更好的腫瘤治療效果。從以上的概括總結(jié)可以看出，研究者們對將該劑型用于腫瘤的臨床治療抱有極大的信心，紫杉醇白蛋白納米粒將在未來癌癥的治療中發(fā)揮越來越重要的作用。

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