魏志豪，孫遠(yuǎn)梅，李 博，王 曾，張開林，王培榮，朱晨光，蒲曉輝，袁 琦

河南大學(xué) 藥物研究所，河南 開封 475004

腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種化療藥物產(chǎn)生耐藥性后，對(duì)其他多種化療藥物也產(chǎn)生不同程度的耐藥性，致使藥物的療效不斷下降。MDR造成抗腫瘤藥物治療效果更加不盡人意，以至于治療失敗甚至導(dǎo)致患者死亡[1]，是臨床上導(dǎo)致腫瘤化療失敗的主要原因之一。因此，尋找高效低毒的MDR逆轉(zhuǎn)技術(shù)對(duì)改善腫瘤的化療效果顯得至關(guān)重要。

聚乙二醇單甲醚屬于醚類，相比于聚乙二醇，聚乙二醇單甲醚性質(zhì)更加穩(wěn)定，毒性也明顯降低，對(duì)人體傷害較小。且其在化學(xué)合成中容易進(jìn)行化學(xué)修飾，因此被廣泛應(yīng)用于材料合成以及制劑當(dāng)中[2]。去氧膽酸(DCA)是一種生物表面活性劑[3]，且作為肝臟合成的一種天然化合物具有良好的生物相容性；去氧膽酸在國際上公認(rèn)是一種生物相容性很好而廣泛應(yīng)用于納米制劑的穩(wěn)定劑，而且研究表明[4]對(duì)納米粒子具有長循環(huán)作用，它本身也具有抗紅細(xì)胞聚集等作用。

我們以乙?；Z去氧膽酸為疏水部分，聚乙二醇單甲醚為親水部分，設(shè)計(jì)、合成了生物相容性好、生物可降解的兩親性高分子聚合物材料(mPEG-CDCA)，通過核磁共振、紅外光譜等表征手段確定了結(jié)構(gòu)，運(yùn)用熒光探針法測得臨界膠束濃度(CMC)，結(jié)果顯示，聚乙二醇單甲醚-鵝去氧膽酸聚合物作為膠束載藥系統(tǒng)的載體具有很大的潛力及應(yīng)用前景。此后，我們將進(jìn)一步對(duì)其制劑學(xué)性質(zhì)及抗腫瘤多藥耐藥作用進(jìn)行研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

AVATAR360型傅立葉變換紅外光譜儀(美國)；AVANCE 400核磁共振譜儀(瑞士)；F7000熒光分光光度計(jì)(日本)。

聚乙二醇單甲醚(mPEG，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；二氯甲烷(CH2Cl2，天津市科盟化工工貿(mào)有限公司)；丙酮(CH3COCH3，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；鹽酸(HCl，中國平煤神馬集團(tuán)開封東大化工有限公司)；無水乙醚(Et2O，天津德恩化學(xué)試劑有限公司)；無水碳酸鈉(Na2CO3，天津德恩化學(xué)試劑有限公司)； N，N-二甲基甲酰胺(DMF，天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司)；N-羥基丁二酰亞胺；N, N-二環(huán)己基碳酰亞胺(C13H22N2，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙酸酐(AC2O，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；鵝去氧膽酸(CDCA，C24H40O4，安徽天啟化工科技有限公司)。

1.2 聚乙二醇單甲醚-乙?；Z去氧膽酸的合成

聚乙二醇單甲醚-乙?；Z去氧膽酸的合成如圖1所示，具體操作如下：將11 mmoL CDCA與3.3 mmoL DMAP溶解于裝有100 mL四氫呋喃燒瓶中，在室溫下攪拌30 min使其完全溶解，轉(zhuǎn)速為400 r/min，然后逐滴加入乙酸酐(AC2O)50 mmoL，在70 ℃下加熱回流反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后減壓濃縮。后加入適量的乙酸乙酯使其完全溶解，用蒸餾水進(jìn)行萃取直至酸味消失，然后用飽和NaCl繼續(xù)萃取2次，取上層乙酸乙酯倒入燒瓶中加入無水硫酸鎂，搖勻，靜置2 h。過濾，旋蒸至固體。為白色粉末。薄層色譜分析Rf為0.47，展開劑為(正己烷與乙酸乙酯的質(zhì)量比為10∶3)，用柱色譜法進(jìn)行純化產(chǎn)品，洗脫劑為(正己烷與乙酸乙酯的質(zhì)量比為20∶1)，接收洗脫液旋蒸得到白色精制產(chǎn)品。

將乙?；Z去氧膽酸3.75 mmoL與聚乙二醇單甲醚1.37 mmoL溶解于100 ml的無水二氯甲烷 (CH2Cl2) 中，再在冰浴下加入DMAP 3.75 mmoL與DCC 3.75 mmoL，待全部溶解完畢后，室溫下通入氮?dú)獗Ｗo(hù)反應(yīng)48 h。反應(yīng)完畢后加入飽和NaHCO3溶液萃取3次，再用飽和NaCl溶液萃取3次。取出有機(jī)層進(jìn)行薄層分析Rf=0.5(二氯甲烷、甲醇、醋酸的體積比為10∶1∶0.05)，運(yùn)用柱分離純化產(chǎn)品，洗脫劑為(二氯甲烷、甲醇、醋酸的體積比為20∶1∶0.05)，接收的洗脫液旋蒸干燥后得到白色產(chǎn)品。

1.3 結(jié)構(gòu)表征

采用KBr壓片法，用AVATAR 360型傅立葉變換紅外光譜儀測定紅外光譜；用AVANCE 400型核磁共振譜儀測定各樣品的氫譜，溶劑為CDCl3或DMSO，內(nèi)標(biāo)為TMS，溫度25 ℃。

1.4 臨界膠束濃度(CMC)測定

稱量10 mg的聚合物置于20 mL西林瓶中，瓶中各加10 mL DMF，然后取10mLDMF溶液放入透析袋(透析袋截留量1.5 KD)，在1L燒杯中透析48 h，透析介質(zhì)為蒸餾水，透析過程中每隔4 h更換一次蒸餾水每次更換量為1 L。透析完成后聚合物溶液以3 000 r/min離心30 min，并用0.45 μm的濾膜過濾得到略帶藍(lán)色乳光的膠束溶液，將其用蒸餾水稀釋成不同濃度，分別加入到盛有預(yù)先配好的芘-丙酮溶液的棕色瓶中(芘的最終濃度5×10-7mol/L)，超聲15 min，并在37 ℃和轉(zhuǎn)速為120 r/min下恒溫振蕩器中孵育24 h，用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測定。激發(fā)波長335 nm，發(fā)射波長為373 nm和383 nm。

圖1 聚乙二醇單甲醚-鵝去氧膽酸的合成

2 結(jié)果與分析

2.1 核磁共振

為了證實(shí)是否獲得每一步合成的目標(biāo)產(chǎn)物，我們分別對(duì)上文兩步合成所得產(chǎn)物和mPEG原料進(jìn)行了NMR氫譜分析，結(jié)果分別見圖2。

a：乙?；Z去氧膽酸的NMR圖；b：聚乙二醇單甲醚的核磁共振圖；c：PEG-CDCA的核磁共振圖。圖2 聚乙二醇單甲醚-鵝去氧膽酸的核磁共振圖

由圖2a可知，0.91(s,3H,CH3)、0.94(d,3H,CH3,J =6.45)、0.99(s,3H,CH3)為CDCA環(huán)上的甲基質(zhì)子峰, 1.10～2.39(m,28H)為CDCA的四個(gè)六元環(huán)的亞甲基質(zhì)子峰，0.6(s,3H)為CDCA側(cè)鏈18位上的甲基質(zhì)子峰，11.97(s,H)為CDCA的羧基質(zhì)子峰，且在2.01 ppm和2.04 ppm處出現(xiàn)新的信號(hào)峰則為乙酰基。結(jié)果顯示表明乙酸酐對(duì)CDCA的乙酰化成功。由圖2b可以明顯看出，3.47～3.83 ppm為(-CH2CH2O-)重復(fù)單元的位置。由圖2c可看出，在0.91、0.94、0.97 ppm的位置上為乙酰化鵝去氧膽酸環(huán)的3個(gè)甲基信號(hào)峰，且在2.01ppm和2.04ppm處是乙?；?個(gè)峰，CDCA上的各峰的化學(xué)位移沒有明顯變化，在3.54～3.84 ppm表示的是聚乙二醇單甲醚中(-CH2CH2O-)信號(hào)峰，且在11.97(s,H)的羧基質(zhì)子峰消失。果表明乙?；腃DCA通過酯化反應(yīng)鏈接上聚乙二醇單甲醚。

2.2 傅里葉紅外光譜

通過分析圖3可以得出，如下結(jié)構(gòu)信息：在乙?；懰嶂?，在2 941.48 cm-1、2 867.3 cm-1為乙?；Z去氧膽酸中亞甲基與甲基的VC-H的伸縮振動(dòng)峰；1 731.24 cm-1乙?；Z去氧膽酸中羧基的C=O伸縮振動(dòng)峰；1 245.32 cm-1為乙?；Z去氧膽酸的C-O-C的伸縮振動(dòng)峰，說明成功合成了乙?；Z去氧膽酸。在mPEG中，1 116.89 cm-1為聚乙二醇單甲醚中C-O的伸縮振動(dòng)峰；2 878.48 cm-1為聚乙二醇單甲醚的甲基的C-H的伸縮振動(dòng)峰。在mPEG-CDCA中， 1 731.24 cm-1處出現(xiàn)了酯的C=O伸縮振動(dòng)峰且在1 116.89 cm-1處出現(xiàn)了聚乙二醇單甲醚的C-O-C的伸縮振動(dòng)峰，因此以上信息也佐證了mPEG-CDCA的成功合成。

圖3 乙?；懰?、mPEG、mPEG-DCA的紅外圖譜

2.3 臨界膠束濃度濃度的測定

臨界膠束濃度是表面活性劑和兩親性聚合物最基本的重要參數(shù)，是表面活性劑和兩親性聚合物形成膠束所需濃度的一種量度，它的大小反映了表面活性劑和兩親性聚合物形成膠束的能力。臨界膠束濃度的測定方法有多種，本文運(yùn)用的是芘熒光探針法。芘熒光探針法主要原理是利用膠束對(duì)芘增溶作用來實(shí)現(xiàn)的。有文獻(xiàn)報(bào)道，芘在不同波長下熒光強(qiáng)度與其所處的環(huán)境極性有關(guān)，通常兩親性共聚物在水溶液中形成膠束的過程中，芘會(huì)被膠束所包裹，從而使其所處環(huán)境的極性發(fā)生變化，導(dǎo)致芘熒光光譜中I383/I373的比值發(fā)生突變[5]。因此，我們選擇熒光探針法測定mPEG-DCA的CMC值，其測定曲線如圖4所示。

從圖4可以看出，在較低濃度時(shí)I383/I373值趨于平穩(wěn)，變化不大；隨著聚合物濃度的增大，I383/I373值發(fā)生了突變，此時(shí)聚合物的濃度達(dá)到了形成膠束的臨界值，即此時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度就是臨界膠束濃度。通過測定，得出mPEG-CDCA的CMC值為17.3×10-3mg/L，由此來看，其CMC遠(yuǎn)低于常見的其他兩親性聚合物[6]，其膠束的成型性可能較好。因此，我們推斷，本文合成的mPEG-CDCA兩親性聚合物形成的膠束可能具有良好的稀釋穩(wěn)定性[7]。

圖4 mPEG-CDCA的臨界膠束濃度圖

3 討論

為了促進(jìn)反應(yīng)更好的進(jìn)行，文中采用4-二甲氨基吡啶(DMAP)和N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)作為催化劑和脫水劑。DMAP能夠活化羧基，使其生成中間體，而DCC除做為脫水劑生成DCU之外也可作為催化劑使用，兩者合用共同促進(jìn)反應(yīng)向生成產(chǎn)物的方向進(jìn)行。

聚合物材料的純度是影響制劑學(xué)研究的關(guān)鍵因素，為得到較為純凈的產(chǎn)物，文中采用蒸餾水對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行萃取，目的是除去部分DMAP及乙酸酐(遇水生成醋酸)。而反應(yīng)中所用的飽和碳酸氫鈉是用于除去多余的乙酰化鵝去氧膽酸。然后反應(yīng)產(chǎn)物用柱層析法提純，通過調(diào)試不同的洗脫液比例，最終確定二氯甲烷、甲醇、醋酸的最佳比例為20∶1∶0.05。以此比例進(jìn)行柱層析得到的終產(chǎn)物純度最高。最后對(duì)其進(jìn)行核磁與紅外表征，確定終產(chǎn)物是否成功合成。

一般來說臨界膠束濃度(CMC)是指聚合物分子分散在溶液中開始形成膠束時(shí)的濃度，是聚合物能否形成膠束的關(guān)鍵衡量值。據(jù)文章報(bào)道，TPGS可以形成膠束，但是由于其CMC(在37 ℃下是0.02%W/W)相對(duì)較高，導(dǎo)致在血漿中不穩(wěn)定[8]，隨疏水基 (親油基)中碳原子數(shù)目的增加，其溶解度、CMC等皆有規(guī)律地減小。因此，在實(shí)驗(yàn)材料合成過程中，首先用乙酸酐對(duì)CDCA的羥基進(jìn)行乙?；?，用于增加膽酸的親脂性，從而獲得較小的CMC值，保證其在體液稀釋的情況下穩(wěn)定存在。所得結(jié)果顯示，乙?；膍PEG-CDCA的CMC值為17.3×10-3mg/L，相對(duì)于TPGS較小，可以推測其形成的膠束在血漿中可能具有較好的穩(wěn)定性。綜上所述，mPEG-DCA能夠作為一種新型的載藥材料，并且有望用其制備出一種穩(wěn)定性好、具有抗MDR作用的膠束納米載藥系統(tǒng)。

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