郭秀春，杜建南，徐志遠，岳 寧，武鵬偉，康文藝

1.河南大學(xué) 中藥研究所,河南 開封 475004； 2.開封市保健食品功效成分研究重點實驗室，河南 開封 475004

臍橙是世界各國競相栽培的柑桔良種。臍橙皮富含豐富的色素、果膠、纖維、維生素、橙皮苷、橙皮油、礦物質(zhì)、糖分等[1]營養(yǎng)物質(zhì)。尤其是多糖，它是生命代謝不可或缺的物質(zhì)。但是，目前國內(nèi)外對臍橙皮的研究多針對黃酮類化合物[2]、色素[3]、果膠[4]、橙皮苷[5]等，而對其中多糖的研究甚少。國內(nèi)外大量的研究證明，多糖具有很多生理活性，如抗腫瘤、抗病毒、降血糖、抗炎、抗補體、抗氧化性、減緩血液凝固等[6-7]。

目前，多糖的提取方法可分為三大類[8-9]：溶劑浸提法，儀器輔助提取法，酶提取法。溶劑浸提法有水提取、堿提取、酸提取；儀器輔助提取法有微波輔助提取、超聲波輔助提取、超高壓輔助提取。溶劑提取法作為常用的提取法，具有成本較低、易于操作等優(yōu)點，但是運用此法提取效率不能得到很好的保證，提取效率低且耗時[10]。酶提取法條件溫和，雜質(zhì)易除，不過酶的種類較多[11]，故實驗中不宜確定最適合的酶，且部分酶價格比較昂貴。儀器輔助提取法中的超聲波輔助提取法雖然可能會影響多糖的活性，但是這種方法可以大大縮短提取時間，成本較低，工藝簡便，投資少，對環(huán)境無污染，安全無毒，可用于對熱敏物質(zhì)的提取，且提取效率高[12]。本實驗利用超聲波法提取臍橙皮中的多糖，以苯酚-硫酸法測定多糖的含量并計算出提取率，研究其抗氧化性，并用氣相色譜法分析多糖組成。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

臍橙皮，無水葡萄糖(分析純)，濃硫酸(分析純)，三氯甲烷(分析純)，正丁醇(分析純)，乙醇(分析純)，甲醇(色譜純，天津基準化學(xué)試劑有限公司)、DPPH(日本東京化成工業(yè)株式會社)，純水，ABTS(美國Fluka公司)，BHA(比利時Acros organics公司)，BHT(比利時Acros organics公司)，過硫酸鉀，鹽酸羥胺、三氟乙酸(優(yōu)級純，Merck公司)，吡啶(分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠)，醋酸酐。標準單糖：L-鼠李糖，L-阿拉伯糖，D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，D-半乳糖，D-果糖(Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)。苯酚溶液：稱取苯酚5 g，將其放入50～60 ℃的水浴中融化，然后加入95 mL蒸餾水溶解，置于棕色瓶內(nèi)放入冰箱備用。

1.2 儀器與設(shè)備

400Y粉碎機，索式抽提器，真空泵，超聲清洗儀(寧波新芝生物科技股份公司)，ZDHW電熱套，電子天平(美國Mettler-Toledo)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司)，混旋儀，TRACE1310氣相色譜儀(美國Thermo公司)，Multiskan MK3酶標儀(美國Thermo Electron公司)，LL-1500型冷凍干燥儀(Thermo)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒儀器有限公司)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州翔天實驗儀器廠)，DY-3型安瓿瓶熔封機，AB135-S型十萬級電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，瑞士)。

2 方法

2.1 材料處理

將臍橙皮烘干后，用粉碎機粉碎，得臍橙皮粉末。將臍橙皮粉末顆粒用紗布包好，置于索式抽提器中，加入適量乙醇回流2 h脫脂，重復(fù)脫脂2次，40 ℃烘箱中烘至恒重，得到去除油脂和色素的臍橙皮干粉，備用。

2.2 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定總的粗多糖含量[13]，以葡萄糖做標準品。

2.2.1 標準曲線的制備 參考文獻[14]的方法，稍作改動。準確稱取105 ℃下干燥至恒重的葡萄糖標準品0.100 0 g，加適量蒸餾水溶解轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度線搖勻，制得質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的葡萄糖標準儲備液。精密量取質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的標準儲備液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中定容，搖勻，備用。

取不同稀釋液各200 μL于比色管中，先加入200 μL苯酚溶液搖勻，迅速加入1 000 μL濃硫酸，搖勻，將其在室溫下靜置30 min，冷卻。另取200 μL蒸餾水，同法配成空白溶液，作對照。用酶標儀于波長490 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，葡萄糖標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標繪制曲線，并計算出線性回歸方程。

2.2.2 臍橙皮多糖的提取工藝 準確稱取1.000 g預(yù)處理后的原料，用水做溶劑，以一定液料比，在一定超聲功率、超聲時間以及超聲溫度的作用下提取多糖，減壓抽濾，抽濾后合并濾液，棄去濾渣。取合并后的濾液，加入其3倍體積的乙醇進行沉淀，多糖呈絮狀沉淀析出，將其置于4 ℃冰箱中靜置過夜后，以4 000 r·min-1離心5 min得多糖沉淀。取沉淀的全部多糖用蒸餾水復(fù)溶至100 mL，將全部的水復(fù)溶溶液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，按提取液的1/5量加入sevage試劑[15]，振搖，靜置至分層,去除交界處的變性蛋白和下層有機相，保留上層水相,重復(fù)操作三次，收集上清液以4 000 r·min-1離心5 min,合并上清液，即得到脫蛋白的粗多糖溶液。

臍橙皮多糖提取率的測定：

粗多糖提取率=C×V×N×10-3/M×100%。

式中，C為粗多糖溶液的濃度(mg·mL-1)，V為多糖定容的體積(50mL)，N為稀釋倍數(shù)，M為臍橙皮粉末的質(zhì)量(g)

2.3 臍橙皮多糖抗氧化性的評價

2.3.1 臍橙皮多糖對DPPH自由基清除率的分析參照文獻[16]，略作改動。采用梯度稀釋法將樣品配成一系列不同的濃度，取10μL樣品加入175μLDPPH(200μmol·L-1)的甲醇溶液，混合，37 ℃避光反應(yīng)30min后，酶標儀515nm處測其OD值。每份樣品重復(fù)操作3次。

按公式計算：清除率=[1-(OD1-OD2)/(OD3-OD4)]×100%。(1)

式中，OD1為10μL樣品與175μLDPPH甲醇溶液混合后的吸光度值，OD2為10μL樣品與175μL甲醇溶液混合后的吸光度值，OD3為10μL純水與175μLDPPH甲醇溶液混合后的吸光度值，OD4為10μL純水與175μL甲醇溶液混合后的吸光度值。

2.3.2 臍橙皮多糖對ABTS自由基清除率的分析參考文獻[17]，將樣品配成一系列濃度，精密稱取13.40mgABTS、3.30mg過硫酸鉀，分別加入3.5mL水、5.0mL水，兩者混合后常溫下暗處放置12h以上。取混合溶液1mL，用約50mL甲醇溶液稀釋，使其在734nm處的吸光度值在0.7～0.8之間，即配成ABTS工作液。設(shè)樣品組、樣品對照組、對照組、空白對照組。樣品組：10μL樣品加200μLABTS工作液；樣品對照組：10μL樣品加200μL甲醇溶液；對照組：10μL純水加200μLABTS工作液；空白對照組：10μL純水加200μL甲醇溶液。各組重復(fù)3次，振蕩混合，37 ℃暗處反應(yīng)30min，波長405nm處測定OD值。清除率按公式(1)計算。

2.4 氣相色譜法分析臍橙皮多糖的主要單糖組成

2.4.1 標準單糖的衍生化 精密稱取標準單糖10.00mg，置于尖底燒瓶中，依次加入鹽酸羥胺10.00mg、吡啶0.5mL，振蕩搖勻，放入90 ℃水浴中加熱反應(yīng)30min，取出自然冷卻至室溫，加入0.5mL醋酸酐，90 ℃水浴繼續(xù)反應(yīng)30min進行乙?；磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)0.22μm濾膜過濾，得到標準儲備液；用相同的方法制備混合標準單糖儲備液。

2.4.2 樣品多糖的水解 精密稱取樣品10.00mg置于EP管中，加入1mL4mol·L-1的三氟乙酸，混旋溶解，轉(zhuǎn)至5mL安瓿瓶，充氮氣封管。置于110 ℃的恒溫箱中水解12h后取出，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去三氟乙酸溶液，加入少量甲醇溶解，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥，如此重復(fù)多次，直至三氟乙酸除凈，得到水解物備用。

2.4.3 單糖的衍生化 取樣品多糖的水解物，進行衍生化，方法同標準單糖衍生化一樣，最終得到供試品溶液。

2.4.4 氣相色譜條件 色譜柱：ThermeTG-Waxms(30m×0.32mm,0.5μm)；進樣口溫度：250 ℃；FID檢測器溫度：280 ℃；色譜柱程序升溫：初始溫度100 ℃保持1min，然后以4 ℃·min-1的速率由100 ℃升到230 ℃，保持10min；載氣：高純N2，流速為2mL·min-1；進樣量：2μL。

3 結(jié)果與分析

3.1 標準曲線的繪制

以葡萄糖為標準品繪制的標準曲線的線性回歸方程為Y=6.4881x-0.0084,相關(guān)系數(shù)r=0.997 4。結(jié)果表明葡萄糖質(zhì)量濃度在0.01～0.12mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好，結(jié)果如圖1所示。

圖1 葡萄糖標準曲線

3.2 單因素實驗及其分析

3.2.1 料液比對臍橙皮多糖提取率的影響 料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60g·mL-1，超聲功率200W，時間30min，溫度30 ℃，探究料液比對多糖提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

根據(jù)圖2可知，在一定范圍內(nèi)多糖的提取率隨加水量的增加而增大，當液料比達到1∶30g·mL-1后，提取率隨加水量的增加而呈緩慢降低的趨勢。出現(xiàn)此情況的可能原因是，對于一定量的臍橙皮粉末，在一定范圍內(nèi)，當水增加時，其與水的接觸面積增加，有利于多糖溶出。當水量過多時，水會吸收超聲波的輻射，從而使細胞破壁作用降低，多糖提取率趨于緩慢[18]。料液比選擇1∶30g·mL-1為宜。3.2.2 超聲時間對臍橙皮多糖提取率的影響 超聲時間分別為20、30 、40 、50和60min，料液比1∶30g·mL-1，超聲功率200W，超聲溫度30 ℃，探究超聲時間對多糖提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖2 料液比對多糖提取率的影響

圖3 超聲時間對多糖提取率的影響

從圖3可以看出，在一定范圍內(nèi)，多糖的提取率隨著超聲時間的增加呈緩慢上升的趨勢，超聲時間為50min時，提取率達到最大，之后提取率隨時間的增加明顯降低。出現(xiàn)此情況的原因可能是，超聲波具有較強的機械剪切作用，當超聲時間過長時，大分子多糖的糖苷鍵被破壞，從而導(dǎo)致多糖提取量下降[19]。因此，超聲時間選擇50min為宜。

3.2.3 超聲溫度對臍橙皮多糖提取率的影響

超聲溫度分別為20、30 、40、50和60 ℃，料液比1∶30g·mL-1，超聲功率200W，超聲時間50min，探究超聲溫度對多糖提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 超聲溫度對多糖提取率的影響

由圖4可以看出，在一定范圍內(nèi)，多糖的提取率隨著提取溫度的增加而持續(xù)升高，20～40 ℃之間升高程度不明顯，而40～60 ℃之間有明顯的上升。出現(xiàn)此情況的可能原因是當溫度過低時，多糖不能充分溶解，提取率較低；當溫度過高時，多糖會分解，提取率趨于平緩。根據(jù)表中曲線的趨勢推測隨著溫度的增加多糖的提取率也會有一定程度的升高，但考慮到儀器的承受能力以及客觀的現(xiàn)實耗能情況等，超聲溫度選擇60 ℃為宜。

3.3 最佳條件的平均提取率

精確稱取1g臍橙皮粉末3份，在料液比1∶30g·mL-1、超聲時間50min、超聲溫度60 ℃的條件下提取多糖，計算平均提取率，結(jié)果如表1所示。從表1可知，多糖的平均提取率為5.013 %，相對標準偏差為1.71 %，則該條件下提取率較穩(wěn)定。

表1 平均提取率

3.4 臍橙皮多糖抗氧化性的評價

按照2.3的方法進行試驗，結(jié)果如表2所示。由表2可知，隨著多糖質(zhì)量濃度的增大，其對DPPH自由基的清除率就越大，當多糖濃度為25mg·mL-1時，清除率超過50 %，IC50為20mg·mL-1；由表2可知，隨著多糖質(zhì)量濃度的增大，其對ABTS自由基的清除率就越大，當多糖濃度為2.5mg·mL-1時，清除率超過50 %，IC50為2.0mg·mL-1。由此表明清除率與多糖的質(zhì)量濃度存在一定的量效關(guān)系，臍橙皮多糖具有良好的抗氧化性。

3.5 氣相色譜法分析臍橙皮多糖的主要單糖組成

3.5.1標準單糖檢測 按照2.4.1的方法制備混合標準單糖儲備液后，再按照2.4.4的方法用氣相色譜法分析混合標準單糖儲備液，結(jié)果如圖5所示。

1.果糖；2.鼠李糖；3.阿拉伯糖；4.木糖；5.甘露糖；6.葡萄糖；7.半乳糖圖5 混合標準單糖的氣相色譜圖

3.5.2 臍橙皮多糖的單糖分析 按照2.4的方法對臍橙皮多糖處理后，用氣相色譜法分析多糖的主要單糖組成，結(jié)果如圖6所示。根據(jù)樣品各色譜峰與

表2 臍橙皮多糖抗氧化性結(jié)果

標準品色譜峰的對照，可以確定臍橙皮多糖的主要單糖組成為果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，保留時間分別為17.006、17.388、17.775、22.645、23.078、23.715min。

圖6 臍橙皮多糖分析的氣相色譜圖

4 討論

超聲波法提取多糖是利用了超聲波的高頻振蕩的空化作用，機械剪切作用和熱力學(xué)作用，相比于其他提取方法，超聲波法具有省時快速，提取率高，操作簡便等優(yōu)點；單因素試驗結(jié)果表明，臍橙皮多糖提取的最佳工藝參數(shù)為料液比1∶30 (g·mL-1)、超聲時間50min、超聲溫度60 ℃。在此工藝條件下進行試驗驗證，測得臍橙皮多糖的平均提取率為5.013%，重現(xiàn)性良好，可用于臍橙皮多糖的提取和含量的測定。

臍橙皮多糖的抗氧化性研究結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，隨臍橙皮多糖質(zhì)量濃度的增大，其對DPPH自由基和ABTS自由基的清除率越大，說明臍橙皮多糖具有抗氧化性。

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