李海云,林玉坤，張舒慧，段永建，杜鋼軍

1.河南大學(xué)藥學(xué)院 藥物研究所，河南 開封 475004； 2.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 開封 475004

目前，惡性腫瘤占全球死因的第1位，而肺癌是癌癥相關(guān)死亡的首要原因[1]，5 年內(nèi)生存率僅有15%。根據(jù)預(yù)測，到2020年，中國將有550萬新發(fā)肺癌病例，死亡的人數(shù)將達400萬[2]。在我國，無論城市、農(nóng)村都是肺癌發(fā)病率及死亡率的高發(fā)地。吸煙、大氣污染、遺傳/家族性因素、放射性暴露都能成為肺癌發(fā)生的致病因素[3]。汪宗發(fā)等[4-5]提到，肺癌是因為陰陽失衡，正氣虛損，邪毒趁機侵入肺腑，引起肺臟功能失調(diào)，導(dǎo)致肺氣郁結(jié)于內(nèi)，血行受阻，津液循環(huán)受限，津聚化痰，淤阻脈絡(luò)，痰聚氣滯，使得瘀毒膠結(jié)。因此，日積月累肺部便生長出肺積塊，它本質(zhì)屬陰邪。肺癌是因為虛損而病發(fā)，因虛而致實，是因虛而致病，是全身性疾病的一個局部的表現(xiàn)[6]。其虛一般都是氣虛、陰虛和氣陰虛。表現(xiàn)出的則是毒聚、氣滯、血瘀、痰凝的病理變化。

中藥辣椒素具有多種藥理活性，如鎮(zhèn)痛、降脂、抗真菌、抗炎及抗肝癌等[7]。黃媛媛[8]研究報道稱，辣椒素可以通過抑制NF-KB表達，下調(diào)XIAP的表達，抑制胰腺癌細胞裸鼠移植瘤生長。但在《全國中草藥匯編》中提示，辣味具有發(fā)散、行氣、活血化瘀的藥理效用，過多攝入易導(dǎo)致肺氣過盛，耗傷氣陰，導(dǎo)致免疫力降低。因此，從中醫(yī)角度講，辣椒素對腫瘤是否具有抑制作用，仍有待考究。且辣椒素對于陰虛、氣虛的患者反而加重癥狀。近年，國內(nèi)趨向于對辣椒素抑制腫瘤生長狀況的研究和報道，但也有研究提到辣椒素的致突變及致癌作用。本實驗對烏拉坦誘導(dǎo)的小鼠肺癌模型在給予辣椒素(25 mg/kg)后，觀察辣椒素對小鼠肺癌模型的影響。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

實驗動物：昆明小鼠，雌性，體質(zhì)量25～30 g，采購于河南省實驗動物中心。

1.2 實驗試劑與儀器

1.2.1 試劑 CMCNa (國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；烏拉坦(上海化學(xué)試劑廠產(chǎn)品)；體積分數(shù)4%的多聚甲醛、蘇木精、伊紅(美國Sigma)；PBS緩沖液、蒸餾水、鹽酸酒精、不同梯度的酒精(用無水乙醇配制)、EDTA-2Na(鄭州市宏播利化工有限公司)；中性樹脂(開封市天濟大藥房)；辣椒素(開封市天濟大藥房)；TF ELISA測定試劑盒(北京方程佰金科技有限公司)；血細胞分析儀通用稀釋液(北京瑞博賽工貿(mào)有限公司)。

1.2.2儀器 電子天平(上海精密儀器有限公司有限公司天平儀器廠)；電子體溫計(香港泰克曼電子儀器有限公司)；EM-KC150數(shù)顯游標卡尺(河?xùn)|區(qū)星光扳鉗工具廠)；ZH-YLS-1A多功能小鼠自主活動記錄儀(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)；正置顯微鏡XDS-500D(奧林巴斯，日本東京)；KD202C轉(zhuǎn)輪式切片機(浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司)；高速冷凍離心機(北京京立離心機有限公司)；XFA6130全自動動物血液細胞分析儀(南京普明醫(yī)療設(shè)備有限公司)；冰箱(坂田)；J-HH-4A精密數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海勝衛(wèi)科技有限公司)等。

2 實驗方法

2.1 建立小鼠肺癌模型

采用多次腹腔注射烏拉坦(600 mg/kg)，1次/周，連續(xù)注射10周，建造肺癌模型。

2.2 實驗分組與給藥

將60只小鼠隨機分成模型組，辣椒素組，正常組，每組20只。次日灌胃給藥(辣椒素組：辣椒素25 mg/kg；模型組：蒸餾水0.2 mL/10 g)。1次/d，連續(xù)喂養(yǎng)6 mon。

2.3 檢測指標

2.3.1 一般日常觀察 每周必須觀察3組小鼠的飲食、飲水情況，測量小鼠的體質(zhì)量、體溫和自主活動；對6個月內(nèi)死亡小鼠的死亡數(shù)目進行統(tǒng)計并做記錄，計算死亡率。

2.3.2 腫瘤數(shù)目及瘤直徑計算 實驗結(jié)束，摘眼球取血，頸椎脫臼處死小鼠，解剖分離完整肺組織，拍照，觀察小鼠肺部長瘤情況，統(tǒng)計小鼠肺組織表面腫瘤數(shù)目及測量瘤直徑，計算出腫瘤體積。

2.3.3 臟器指數(shù)計算 解剖得到的小鼠完整心、肝、脾、肺、腎進行稱重，并計算臟器指數(shù)。

2.3.4 血常規(guī)分析 實驗結(jié)束，摘眼球取血收集小鼠血液，選擇預(yù)稀釋模式進行血常規(guī)分析，記錄并分析數(shù)據(jù)。

2.3.5 組織因子含量分析 使用IF ELISA試劑盒，測量小鼠血清中組織因子含量，并進行分析。

2.4 病理指標檢測

小鼠處死后，收集各組小鼠肺組織，做好標記，將各組小鼠肺組織浸泡在體積分數(shù)4%的多聚甲醛溶液中，兩天后進行石蠟包埋，切取4 μm制片，乙醇脫水透明，然后做封片處理。作HE染色片，于顯微鏡下觀察小鼠肺組織的病理生理形態(tài)變化。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

用GraphPad Prism 5.0軟件對本實驗得到的數(shù)據(jù)進行分析。結(jié)果采用t檢驗，比較辣椒素組和模型組間的差異性，樣本數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析。P<0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義；P<0.01，具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 血常規(guī)分析辣椒素對WBC、LY的影響

與正常組相比，辣椒素組小鼠血液中WBC含量最低(P<0.05)，其次是模型組，見圖1；而辣椒素組小鼠血液中LY含量最高(P<0.05)，其次是模型組，見圖2。

3.2 對小鼠組織因子(TF)的影響

與正常組相比，辣椒素組小鼠血液中TF含量最高(P<0.05)，其次是模型組，見圖3。

3.3 對小鼠肺組織質(zhì)量的影響

與正常組小鼠比較：辣椒素組小鼠肺臟器指數(shù)最高(P<0.05)，其次是模型組，見圖4。解剖過程中，我們還發(fā)現(xiàn)辣椒素組小鼠肺組織體積比正常組小鼠肺組織體積偏大，體型部分較其他兩組瘦小。

圖1 小鼠血液中WBC含量比較

圖2 小鼠血液中LY含量比較

圖3 小鼠血液中的組織因子(TF)含量比較

3.4 對腫瘤體積和腫瘤數(shù)目的影響

與模型組比較：辣椒素組小鼠肺組織腫瘤數(shù)目低，但腫瘤體積明顯高于模型組,見圖5、圖6。我們發(fā)現(xiàn)造成上述結(jié)果的原因是辣椒素組肺組織腫瘤體積偏大，有的甚至長滿整個小肺葉或是布滿半個肺葉，而模型組的肺組織腫瘤體積偏小，散布在肺組織的不同區(qū)域，見圖7。同時，我們對死亡途中的辣椒素組小鼠肺組織解剖發(fā)現(xiàn)，肺部有出血的情況，實驗結(jié)束后，處理的小鼠中也存在了出血情況，見圖8。

3.5 HE病理學(xué)檢測結(jié)果

正常組小鼠肺泡組織排列整齊，無瘤區(qū)，無炎癥浸潤現(xiàn)象；辣椒素組瘤區(qū)明顯且體積大，有炎癥浸潤現(xiàn)象，細胞核密集，而且核質(zhì)失衡；模型組有炎癥浸潤現(xiàn)象，有瘤區(qū)，但均比辣椒素組情況好，見圖9。

3.6 對小鼠體質(zhì)量、體溫、自主活動、飲水量的影響

結(jié)果顯示：模型組與辣椒素組小鼠體質(zhì)量均有增長趨勢，其中模型組增長較辣椒素組增長緩慢，但無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖10；辣椒素組和模型組小鼠的體溫變化趨勢基本一致，辣椒素組體溫略微高于模型組，趨近于正常組，見圖11；兩組小鼠自主活動變化趨勢基本一致，辣椒素組小鼠自主活動始終高于模型組，見圖12；辣椒素組小鼠飲水量明顯高于模型組，見圖13，可能是因為辣椒素組小鼠在給予辣椒素后，大量飲水所造成的。

圖4 小鼠的肺臟器指數(shù)比較

圖5 小鼠肺部腫瘤的體積比較

圖6 小鼠肺部腫瘤的數(shù)目比較

圖7 小鼠肺組織瘤體表面情況比較

圖8 小鼠肺組織出血情況比較

圖9 小鼠肺組織HE染色圖

圖10 小鼠的體質(zhì)量變化

圖11 小鼠的體溫變化

圖12 小鼠的自主活動變化

圖13 小鼠的飲水狀況統(tǒng)計

4 討論

中藥辣椒素是辣椒屬紅辣椒有效活性成分，它是香草酰胺衍生物，別名辣椒堿，具有刺激性[7]。實驗研究中，給予小鼠辣椒素50mg/kg時，小鼠出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；將給予辣椒素的量更改為25mg/kg后，小鼠飲水量增加，猜測這與辣椒素的刺激性有關(guān)。

本實驗主要探討辣椒素對烏拉坦誘導(dǎo)的肺癌小鼠的影響。實驗中，辣椒素致死率為52.17%，模型死亡率為39.13%，說明辣椒素促進了小鼠的死亡。有研究表明，肺癌容易伴有異常凝血狀態(tài)，這與TF高水平表達，導(dǎo)致TF/TFPI平衡失調(diào)，產(chǎn)生高凝狀態(tài)有關(guān)[9]。實驗顯示，辣椒素組TF含量最高(P<0.05)，解剖得到的小鼠肺組織中，辣椒素組小鼠腫瘤體積大，肺組織表面出現(xiàn)血塊，而模型組沒有出現(xiàn)此現(xiàn)象。說明辣椒素組中TF高表達引起TF/TFPI失調(diào)，進而導(dǎo)致小鼠肺組織凝血異常，加速了小鼠的死亡。血液分析結(jié)果顯示，辣椒素組小鼠血液中的WBC含量值最低(P<0.05)。說明辣椒素可能通過降低了小鼠免疫力而加速腫瘤進程。

腫瘤具有復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境，比如形成的腫瘤脈管，它能促進LY浸潤，又在某種程度上阻礙LY浸潤，比如血管生成調(diào)節(jié)因子的異常表達[10]。VEGF能夠刺激腫瘤脈管的形成及內(nèi)皮細胞的增殖，形成能夠有利于LY浸潤的腫瘤脈管系統(tǒng)[11]；VEGF在大部分實體瘤內(nèi)的高表達，能夠激發(fā)腫瘤內(nèi)新生脈管的生成，從而促進LY對腫瘤的浸潤[12]。實驗結(jié)果表明，辣椒素組小鼠血液中LY含量高于模型組(P<0.05)，說明LY對辣椒素組小鼠肺部腫瘤浸潤程度更高，辣椒素組小鼠患肺癌程度上更為嚴重。實驗中，辣椒素組小鼠是否因為腫瘤內(nèi)VEGF高表達促進了腫瘤脈管的形成導(dǎo)致血管生成調(diào)節(jié)因子異常表達，阻礙了LY的浸潤而導(dǎo)致LY在數(shù)量上蓄積，仍有待進一步研究。

綜上所訴，本實驗研究的25mg/kg辣椒素對烏拉坦誘導(dǎo)的小鼠肺癌具有促進作用。

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