金昭延

摘要：目的 檢測乳腺癌患者mtDNA D-loop環(huán)HV2區(qū)體細胞性突變并探討它在腫瘤發(fā)生中的作用。方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)像多態(tài)性（PCR-SSCP）的方法對20例浸潤性乳腺導管癌組織和癌旁正常組織的mtDNA非編碼區(qū)D-loop環(huán)HV2區(qū)進行分析，將出現(xiàn)異常條帶所有標本進行基因測序。結(jié)果 經(jīng)PCR-SSCP檢測，在20例乳腺癌mtDNA中共發(fā)現(xiàn)7例出現(xiàn)異常條帶；測序結(jié)果顯示，7例測序標本中，HV2區(qū)共檢測到31個新的突變位點，其中有3個屬于微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI），7例移碼突變，其余為點突變（point mutation），7個位點位于復制和轉(zhuǎn)錄的區(qū)域。結(jié)論 浸潤性乳腺導管癌mtDNA HV2區(qū)是一個高度多態(tài)性和突變性的區(qū)域，它與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有重要關(guān)系。

關(guān)鍵詞：浸潤性乳腺癌；mtDNA；HV2區(qū)；聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)像多態(tài)性

Abstract：Objective To detect the effect of mutations of HV2 region of D-loop in mtDNA of the breast cancer.Methods It analysed the HV2 region of D-loop in mtDNA in the 20 cases invasive ductual breast carcinoma and 20 cases paracarcinoma tissues by PCR and PCR-single stranded conformation polymorism.Results The 7 cases exceptional bands were found from 20 breast carcinoma in all of the samples by PCR-SSCP；and the sequencing results indicated that 31 new HV2 mutations were found in 7 sequencing specimens，the 3 of them were mitochondrial microsatellite instability（MSI）；the 7 of them were frameshift mutations；others were point mutation；and the 7 of them located in the region of mtDNA replication and transcription.Conclusion The mtDNA HV2 region is a highly polymorphic and mutatble region，that could be some relations in the breast carcinoma development.

Key words：Invasive ductual breast carcinoma；mtDNA；HV2；PCR-single stranded conformation polymorism

線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）存在于細胞質(zhì)的線粒體中，是細胞內(nèi)唯一的核外遺傳物質(zhì)，由16569bp組成的雙鏈閉合環(huán)狀分子，含有自我復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的遺傳體系。mtDNA含有37個編碼基因，包括編碼氧化磷酸化系統(tǒng)13個蛋白質(zhì)的亞單位、2個rRNA及22個tRNA的結(jié)構(gòu)基因。由于不受組蛋白保護，修復功能不完善，很容易成為致癌物質(zhì)攻擊的標靶。因此mtDNA的突變與細胞癌變之間的關(guān)系已經(jīng)越來越受到重視，成為研究的熱點。本文利用PCR-SSCP和基因測序法對mtDNA D-loop環(huán)HV2區(qū)的基因突變情況進行了研究，并探討了突變在乳腺癌進程中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 取自2004年5月～2005年7月延邊大學附屬醫(yī)院腫瘤外科手術(shù)的患者，20例乳腺癌組織及相對應(yīng)的癌旁正常組織，手術(shù)后切除部分組織立即投入液氮中，后放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?0例乳腺癌患者年齡為36～73歲，平均（51.15±9.54）歲，所選標本均經(jīng)病理確診為浸潤性導管癌。

1.2方法

1.2.1組織DNA提取 應(yīng)用小量組織DNA提取純化試劑盒進行組織DNA的提取，并用1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白定量分析儀進行DNA提取及純度檢測。選用GeneAmp 2400型PCR擴增儀進行PCR擴增。引物序列為HV2：5'-CTC ACG GGA GCT CTC CAT GC-3'（sense）；5'-GAC TGT TAA AAG TGC ATA CCG C-3'（antisense）；擴增產(chǎn)物大小為403bp，在94℃預變性5分，之后進入循環(huán)，94℃30s，退火60℃30s，72℃30s，共35個循環(huán)，后72℃延伸7分，4℃冷卻。2%瓊脂糖凝膠檢驗PCR擴增產(chǎn)物。

1.2.2 PCR-SSCP分析 取PCR產(chǎn)物10μl與等量的2×上樣緩沖液，98℃變性5分，冰浴15 min。然后取該變性液5μl上樣于8%聚丙烯酰氨凝膠，220伏電壓電泳3 h后，進行銀染觀察分析條帶：1%HNO3中氧化20分，蒸餾水中沖洗2次，20s/次；12mM硝酸銀中染色30分，蒸餾水中沖洗2次，20s/次；0.28mM碳酸鈉和0.04%甲醛混合液中顯色至色帶清晰；10%冰醋酸中終止染色固定5分。

1.2.3基因測序 PCR-SSCP分析出現(xiàn)異常條帶者，用相應(yīng)的DNA再次擴增，再經(jīng)過PCR-SSCP分析，仍出現(xiàn)異常條帶者，將PCR產(chǎn)物純化后基因測序分析。

1.3統(tǒng)計學分析 用SPSS 11.5軟件進行數(shù)據(jù)處理，各組實驗結(jié)果用（x±s）表示，采用單樣本t檢驗和單因素方差分析檢驗各組資料間的統(tǒng)計學差異，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.01為差異具有顯著的統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1組織DNA提取、PCR擴增和PCR-SSCP結(jié)果 DNA樣本經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測，OD260/OD280均≥1.7；HV2基因PCR擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測均顯示單一條帶，與DNA Marker所提供的片段定位相符，說明所檢測的片段上沒有明顯的插入和缺失。結(jié)果發(fā)現(xiàn)20例乳腺癌患者中有7例患者經(jīng)過PCR-SSCP分析出現(xiàn)異常區(qū)帶。

2.2測序結(jié)果 本研究在7例乳腺癌組織mtDNA在乳腺癌組織mtDNA D-loop環(huán)HV2區(qū)，有7處發(fā)生移碼突變（單個核插入或缺失）其余均為點突變，轉(zhuǎn)錄因子X（TFX，nt 233-260）有2例3次突變、Y（TFY，nt 276-303）有1例次突變。共有23差異位點位于重鏈起始區(qū)（OH，nt 110-441）。

3 討論

mtDNA與核基因組一樣也存在不穩(wěn)定，其形式以D-loop環(huán)區(qū)（CA）n和polyC長度不穩(wěn)定多見[1-2]。Aral等[3-4]用限制性內(nèi)切酶BsaXI找到了一個迅速檢測D310多態(tài)性的一種方法。甲狀腺癌[5]、乳腺癌、膀胱癌、及子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌中均存在D310區(qū)突變。本研究中11例標本均發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定，且都位于D310區(qū)域，D310是位于D-環(huán)區(qū)303～315的polyC序列，是實體腫瘤突變的熱點，其突變形式多為單堿基插入或缺失。線粒體基因組不穩(wěn)定的原因可能是活性氧的破壞﹑滑鏈錯配和不平衡交換。并且對甲狀腺癌的研究發(fā)現(xiàn)D310區(qū)突變與腫瘤的組織類型和分化程度無關(guān)。負責mtDNA復制的DNA聚合酶γ在4個核苷酸以上的多聚核苷酸區(qū)復制的忠實性低可能是D310區(qū)具有高突變率的主要原因。D310的長度變化可能通過影響mtDNA復制或使腫瘤細胞獲得選擇性生長優(yōu)勢而促進腫瘤的發(fā)生。

本研究使用PCR-SSCP方法檢測測了20例乳腺癌患者的癌組織和癌旁組織HV2區(qū)，共發(fā)現(xiàn)32個多態(tài)性變化。除了與基因庫記載相重復的多態(tài)性變化外，又發(fā)現(xiàn)新的多態(tài)性位點10個，可見HV2區(qū)是一個具有高度多態(tài)性的區(qū)域，而這種多態(tài)性反映了線粒體DNA的核苷酸順序是1981年Sanger等通過對西方人線粒體DNA測序得出的，因此在本研究中發(fā)現(xiàn)的新的多態(tài)性也可能是人種和地域差異的反映。

通過統(tǒng)計分析mtDNA基因突變浸潤性導管癌與乳腺纖維腺瘤無顯著性，但是乳腺纖維腺瘤的突變率要高于浸潤性導管癌提示線粒體變異可能是婦科惡性腫瘤形成過程中的一個早期現(xiàn)象，并持續(xù)存在于癌癥演變的全過程。但由于本研究所測例數(shù)較少，尚有待于進一步證實。因為檢測腫瘤細胞中的mtDNA突變比檢測核DNA（nDNA）突變要簡單可靠，因此，檢測組織細胞中mtDNA突變有可能成為一種腫瘤輔助診斷方法。

參考文獻：

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[4]Yu M，Shi Y，Zhang F，et al.Sequence variations of mitochondrial DNA D-loop region are highly frequent events in familial breast cancer[J].J Biomed Sci，2008，15（4）：535-534.

[5]Ding Z，Ji J，Chen G，et al.Analysis of mitochondrial DNA mutations in D-loop region in thyroid lesions.[J].Biochim Biophys Acta，2010，1800（3）：271-274.

編輯/金昊天