侯宏艷，惠文巧，張丹俊，趙瑞宏，胡曉苗（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，合肥 230031）

安徽地區(qū)羊口瘡病毒VIR基因PCR檢測及遺傳進(jìn)化分析

侯宏艷，惠文巧，張丹俊，趙瑞宏，胡曉苗
（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，合肥 230031）

采集安徽某地區(qū)兩個山羊場中疑似感染ORFV的羔羊唇部結(jié)痂病料，采用PCR方法對毒力基因VIR進(jìn)行了擴(kuò)增，并獲得了目的片段VIR-1和VIR-2。同時將PCR產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體，鑒定后測序。序列分析結(jié)果表明，兩個羊場的毒力基因VIR-1和VIR-2基因片段與參考毒株的相關(guān)基因核苷酸同源性分別為95.8%～100%和95.4%～99.6%?；蜻M(jìn)化樹比較顯示，兩分離株分別與美國AY424975.1株和甘肅KF916586.1株的親緣關(guān)系最近。

安徽；羊口瘡病毒；VIR基因；遺傳進(jìn)化分析

羊口瘡病毒（orfvirus，ORFV）屬于痘病毒科、副痘病毒屬，綿羊和山羊感染后可引起急性、接觸性、嗜上皮性傳染病，臨床表現(xiàn)為羊的口唇、舌、鼻、乳房等部位開始出現(xiàn)紅疹，進(jìn)而發(fā)展為丘疹、水泡、膿皰，最后形成結(jié)痂，以增生性炎癥為典型特征［1］，多種野生動物和人也會感染ORFV而形成持續(xù)性感染，大羊多為隱性感染，有臨床癥狀者多為6月齡以下的羔羊，有15日齡羔羊發(fā)生羊口瘡的報道。發(fā)病羔羊因口唇潰爛而采食困難，嚴(yán)重影響生長發(fā)育，也易繼發(fā)其他疾病，因此，羔羊病死率高達(dá)20%～50%［2］。羊口瘡存在于大部分養(yǎng)羊國家［1］，如澳大利亞、新西蘭、意大利、印度，韓國等。我國新疆、甘肅、內(nèi)蒙古、陜西、四川、福建等多個養(yǎng)羊省區(qū)均有該病發(fā)生和流行情況的報道。

羊口瘡病毒基因組中的干擾素抗性蛋白（interferon resistance protein，VIR）基因是一種主要保守型毒力基因，是干擾素抑制基因，可抑制干擾素的抗病毒效應(yīng)［3-4］。在對羊口瘡流行病學(xué)調(diào)查和抗原性研究方面常常對VIR基因進(jìn)行研究［5-6］。2015年2月—2015年10月，安徽省某地區(qū)兩個山羊場發(fā)生疑似羊口瘡病，為了快速診斷病因，筆者等采用PCR方法對羊口瘡病毒VIR基因進(jìn)行檢測，并對流行病毒的部分基因進(jìn)行了遺傳分析，以探明這兩個羊場中羊口瘡病毒的流行情況。

1 材料與方法

1.1 病料的采集與處理

2015年2月—2015年10月在安徽某地區(qū)兩個羊場采集1～4月齡疑似發(fā)生口瘡病羔羊的唇部痂塊，用無菌0.01mol/L（pH 7.2）PBS液漂洗數(shù)次后剪碎、研磨，用無菌PBS液按體積比為1∶5制成懸液，加青霉素、鏈霉素各2 000U/mL，置4℃冰箱過夜，以5 000 r/min離心10min，取上清液置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

病毒總DNA提取試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、pMD18-T載體和DL 2000Marker等均購自天根生化公司。

1.3 引物

根據(jù)GenBank中VIR基因序列，用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計引物，由上海生物工程有限公司合成。依據(jù)VIR基因設(shè)計的引物序列如下：P1 5'-TTGCTGCGAGGACGGAAACCCG-3'；P2 5'-TGCAGGTGAAGCGCGGACAGTG -3'，預(yù)期擴(kuò)增目的片段大小為284 bp。

1.4 DNA提取及PCR檢測

取1.1中保存的上清液，用病毒總DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體操作按說明書進(jìn)行。以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25μL）：2× Taq mix 12.5μL，ddH2O 8μL，25μM的上下游引物各1μL，DNA模板2.5μL。PCR反應(yīng)條件：95℃變性4min；94℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，共33個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.5 目的基因的克隆與測序

采用DNA凝膠回收試劑盒對回收的目的DNA進(jìn)行純化，純化的PCR產(chǎn)物與pMD 18-T載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上篩選單菌落，接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。提取重組質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、PCR方法鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒，并進(jìn)行序列測定。

1.6 遺傳進(jìn)化分析

利用DNAStar軟件將測定結(jié)果與國內(nèi)外的參考毒株進(jìn)行序列同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測結(jié)果

將病毒基因組的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1）克隆于pMD 18-T載體中，通過瓊脂糖凝膠電泳及PCR鑒定，均得到一致結(jié)果。鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果證實插入的DNA片段大小為284 bp。

圖1 羊口瘡病毒VIR部分基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 序列比較與分析

利用DNAStar軟件將測序結(jié)果與Gen Bank中登錄的Orf病毒不同毒株的VIR序列進(jìn)行比較分析（圖2）。結(jié)果表明，兩個羊場的毒力基因VIR基因片段與參考毒株的相關(guān)基因核苷酸同源性分別為95.8%～100%和95.4%～99.6%，證明該基因較為保守。

圖2 不同羊場VIR部分基因序列分析

2.3 遺傳進(jìn)化關(guān)系

將兩個羊場VIR基因片段與國內(nèi)外發(fā)表的毒株相應(yīng)片段作序列比較，應(yīng)用軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），結(jié)果顯示，VIR-1和VIR-2在一個大的分支中，VIR-1與美國AY424975.1株的親緣關(guān)系較近，而VIR-2與甘肅KF916586.1株的親緣關(guān)系較近。

圖3 不同羊場VIR部分基因遺傳進(jìn)化樹分析

3 討論

羊口瘡病毒能夠編碼一系列抗炎性因子（如VIR），以阻止病毒感染細(xì)胞發(fā)生凋亡而產(chǎn)生免疫逃避，該病毒已被證明為一種變異較強的病毒，各地病毒在感染性、致病性上存在較大差異［7］。目前，安徽地區(qū)羊口瘡的診斷和序列分析鮮見報道，掌握安徽地區(qū)羊口瘡流行病毒病原分子特性有重要意義。因此，本試驗對發(fā)病的2個山羊場首先進(jìn)行了羔羊口瘡的臨床癥狀診斷［6］，取疑似羔羊口瘡痂塊進(jìn)行了PCR檢測，將擴(kuò)增序列進(jìn)行比較后，可判定為羊口瘡病毒陽性。本研究采用PCR快速直接診斷，省去了電鏡觀察或細(xì)胞培養(yǎng)過程，從而便于臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查研究。本試驗還分析了VIR部分基因的遺傳進(jìn)化情況，結(jié)果與參考序列的同源性都在95.4%以上，雖然VIR-1和VIR-2在一個大的分支中，但VIR-1與美國AY424975.1株的親緣關(guān)系較近，VIR-2與甘肅KF916586.1株的親緣關(guān)系較近，推測安徽流行株可能是由幾個毒株重組后產(chǎn)生的。

近年來，安徽省養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展迅速，規(guī)?；驁鰯?shù)量快速增加，由于ORFV弱毒疫苗存在安全隱患以及使用效果的不確切性，很多養(yǎng)羊場不進(jìn)行ORFV的疫苗免疫，羊口瘡已成為安徽省養(yǎng)羊業(yè)的主要疫病之一。如果羊場內(nèi)羔羊發(fā)病率高，建議母羊產(chǎn)前1個月和羔羊出生后10 d進(jìn)行疫苗注射免疫［8］，并從飼養(yǎng)管理、營養(yǎng)、消毒、疫苗等多方面進(jìn)行綜合防控。

［1］De la Concha-Bermejillo A，Guo J，Zhang Z，etal.Severe persistentorf in young goats［J］.Vet Diagn Investigat，2003，15：423-431.

［2］Hosaman iM，Scagliarini A，Bhanuprakash V，et al.Orf：an update on current research and futureperspectives［J］.Exp Rev AntiinfectTher, 2009，7（7）：879-893.

［3］Haig D M,McInnesC J，Thomson J，etal.The orfvirus gene OV20.0L gene product is involved in interferon resistance and inhibits interferon-inducible double-stranded RNA-dependent kinase［J］. Immunology，1998（93）：335-340.

［4］Kottaridi C，Nomikou K，T eodori L，et al.Phylogenetic correlation of Greek and Italian orf virus isolates based on VIR gene［J］.Vet Microbio1，2006，116（4）：310-316.

［5］郭良興，趙魁，趙廣海，等.吉林省2006—2010年羊傳染性膿皰病的流行病學(xué)調(diào)查及分析［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2011，31（11）：1623-1626.

［6］李杰，李前瑞，田婷婷，等.羊口瘡病毒B2L和VIR基因原核表達(dá)及抗原性鑒定［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（3）：1-6.

［7］向智龍，程振濤，卓建華，等.羊口瘡病毒PCR檢測方法的建立與應(yīng)用［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（7）：145-147.

［8］劉文進(jìn)，陶金林，唐燕，等.新疆塔額墾區(qū)羊口瘡診斷與綜合防控［J］.畜牧與獸醫(yī)，2015，47（3）：106-108.

PCR Detection and Phylogenetic Analysisof OrfVirus in Anhui Province

Hou Hongyan，Hui Wenqiao，Zhang Danjun，et al
（Institute of Animal Husbandryand Veterinary Science，Anhui Academy of Agricultural Science，Hefei 230031，China）

The kid lacrimal scabs were collected from two farms in Anhui Province for amplifying the VIR gene by PCR method. Successfully，the target gene were got，and named VIR-1，and VIR-2，respectively.Then，the PCR productwas inserted into pMD18-T Vector，then identified and sequenced.The sequence analysis showed that the nucleotide sequence homology of VIR-1 and the referenced gene was 95.8%-100%，while the nucleotide sequence homology of VIR-2 and the referenced gene was 95.4%-99.6%.The results of phylogenetic tree showed that they were the closest to AY424975.1 strain and KF916586.1 strain respectively.

Anhui；ORFV；VIR gene；genetic evolution analysis

S827.2

A

2095-3887（2017）01-0004-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.01.002

2016-12-01

國家自然科學(xué)基金（31402048）；安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)科建設(shè)項目（16A0413）

侯宏艷（1975-），女，助理研究員，碩士，主要從事動物病原學(xué)研究。通信作者：張丹俊，研究員，主要從事畜禽傳染病學(xué)研究。