豆興堂（遼寧省畜牧科學(xué)研究院，遼陽 111000）

絨山羊母羔體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)操作細(xì)則

豆興堂
（遼寧省畜牧科學(xué)研究院，遼陽 111000）

文章詳細(xì)介紹了遼寧絨山羊母羔體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)的操作流程，包括實驗室要求、母羔超排處理、公羊精液處理、卵母細(xì)胞采集、卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)、體外受精、早期胚胎體外發(fā)育培養(yǎng)、胚胎移植等，并附日程安排、SOF配方、記錄表等，供相關(guān)科技人員參考。

絨山羊；母羔；體外胚胎；體外受精

幼畜體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)（juvenile in vitro embryo transfer，JIVET），即幼畜超排、胚胎體外生產(chǎn)和移植技術(shù)，是提高良種家畜繁殖效率的核心技術(shù)。經(jīng)過多年遼寧絨山羊母羔體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)試驗研究歸納總結(jié)，形成了該技術(shù)操作細(xì)則，供欲建立幼畜體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)體系的科技人員參考。

本操作細(xì)則可供建立絨山羊JIVET技術(shù)體系參考。

1 實驗室要求

1.1 實驗室設(shè)計及環(huán)境

胚胎操作實驗室應(yīng)與其他的實驗室完全分離。實驗室內(nèi)工作臺的裝修與儀器設(shè)備安裝擺放要考慮到整體操作過程中的技術(shù)細(xì)節(jié)與流程，同時應(yīng)考慮實驗室的空間與人員，確保每一個操作步驟都能夠按時完成而不會因為受實驗室條件的限制而推遲。選擇有設(shè)計和建造生物超凈工作室經(jīng)驗的工程師，確保建筑材料無毒、環(huán)保。實驗室最好配備通風(fēng)系統(tǒng)，清楚周圍環(huán)境中的污染物，提供高純度的空氣。試驗室內(nèi)溫度應(yīng)保持在25～30℃，相對濕度保持在40%～60%。室內(nèi)通常不設(shè)洗手池以減少下水道可能帶來的污染，設(shè)置空氣消毒設(shè)備，如紫外線燈或者空氣消毒機等。實驗室啟用前進(jìn)行“熱處理”［1］，打開所有照明及其他設(shè)備電源，可應(yīng)用附加電熱器將室溫調(diào)至30～35℃，打開通風(fēng)系統(tǒng)并調(diào)到最大通風(fēng)量，關(guān)閉實驗室，熱處理持續(xù)10～28 d。

1.2 實驗室儀器設(shè)備

立體顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、CO2氣體瓶、生物光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡、超凈工作臺、離心機、水浴鍋、冰箱、純水儀（MiniQ）、電子分析天平（精度0.000 1 g），1 000μL、0～200μL（可調(diào)）、0～100μL（可調(diào)）、0～20μL（可調(diào)）移液槍至少各一把等。

1.3 實驗室試劑耗材

需要耗材：5mL、10mL玻璃試管若干，50mL、15mL離心管若干，槍頭若干，35mm、90mm培養(yǎng)皿若干，四孔板若干，玻璃巴氏管若干，酒精燈2個，2mL離心管若干，封口膜1卷，100mL、50mL燒杯若干，10mL注射器若干，0.22μm濾器若干等。試劑：TCM199（Sigma或者Gibco）、BSA、HEPES、Na-Lactate、Na-Pryuvate、L-Glutamine、NaCl、MgCl2、CaCl2、KCl、NaH2PO4、KH2PO4、NaHCO3、Nycillin、Heparin、FSH、LH、PMSG、E2、EGF、EAA、NAA、FBS、Hyaluronidase、Minera Oil等，以上試劑除注明外，均為Sigma試劑。

1.4 試劑配制

實驗中所用試劑配制、培養(yǎng)液各組分試劑濃儲液的配制和各試劑的使用注意事項可參照Andras Nagy［2］操作。

1.5 實驗人員要求

熟練掌握胚胎操作，卵母細(xì)胞、受精卵、胚胎的鑒別。熟練掌握培養(yǎng)液配制和無菌操作技術(shù)等。實驗室內(nèi)操作時應(yīng)穿無菌實驗服，戴實驗帽，做好手、手臂消毒等。

1.6 試驗準(zhǔn)備

按照以下各實驗環(huán)節(jié)準(zhǔn)備好母羔羊、受體母羊和實驗儀器耗材，人員分工。制定實驗工作日程和實驗計劃（見附件1）。

2 幼齡母羔超排處理

2.1 幼齡母羔選擇

年齡4～8周齡、體質(zhì)良好、出生體重4.5～8.0 kg、健康、喜好嬉戲、精神狀態(tài)良好、有完整系譜檔案的母羔。超排處理前最好與母羊同圈飼養(yǎng)。

2.2 幼齡母羔飼養(yǎng)管理

在超排處理前至少2周，幼齡母羔應(yīng)該在試驗圈飼養(yǎng)，最好與母羊同圈飼養(yǎng)，以期使其適應(yīng)環(huán)境，減少應(yīng)激。試驗?zāi)父嶂痪诊曃诡w粒料0.15～0.20 kg，自由采食干苜蓿草、飲干凈水。圈舍保持干燥、通風(fēng)良好。

2.3 母羔超排

超排激素為FSH（加拿大）、PMSG。第一天上午7：30肌肉注射FSH 40mg、PMSG 333 IU，晚19：30肌肉注射FSH 40mg；第二天上午7：30肌肉注射FSH 40mg，晚19：30肌肉注射FSH 40mg。最后一針注射后12～16 h采集卵母細(xì)胞，同時超排處理母羔應(yīng)禁食禁水，與母羊同圈飼養(yǎng)。

3 種公羊精液處理

3.1 種公羊要求

年齡2～5周歲，性欲良好，適應(yīng)人工采精，本交配種母羊有產(chǎn)羔史，無疾病，等等。

3.2 采集精液

采集場所做好消毒處理。剪公羊腹毛，將采精公羊腹部的被毛用彎剪剪短，特別是尿道口和尿道口前端及兩側(cè)的被毛盡量剪短，使之在采精時減少或避免與采精工具接觸。清洗種公羊包皮，將青霉素160萬IU、鏈霉素100萬IU，加入150mL的蒸餾水或生理鹽水中全部溶解后，用20mL注射器吸入20mL的藥液，然后用手捏住公羊包皮，將藥液注入，再將包皮外口手捏封閉，用另一手反復(fù)推動包皮內(nèi)的藥液，使之流動，使其在包皮內(nèi)不留死角，與藥液充分接觸，過2min后松開包皮外口，放出藥液。沖洗2次。再用生理鹽水沖洗1次。母羊臀部消毒處理，用75%的酒精對母臺羊后軀的被毛及尾部、外陰進(jìn)行噴霧消毒，一邊噴一邊用手按壓母羊被毛，使消毒液充分滲入。假陰道、集精杯用生理鹽水、酒精清洗消毒處理后備用。采精人員應(yīng)采集1只公羊，換一副手套。精液采集方法按照假陰道采集種公羊精液規(guī)程進(jìn)行。

3.3 冷凍精液制作

采集的種公羊精液，4倍稀釋，顯微鏡下檢查精子活力，慢速降溫平衡，冷凍。解凍精液，活力需達(dá)0.3以上。

3.4 精液培養(yǎng)檢測

按照IVF要求做四孔板，每孔加入IVF液。解凍后的精液檢查活力，吸取少量加入到四孔板的IVF液中，5% CO2、38.5℃培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察精子存活時間、菌落生長情況。每批凍精每個種公羊重復(fù)培養(yǎng)2次。選擇無菌落生長、存活時間12 h以上的種公羊凍精備用。

4 超排母羔采集卵母細(xì)胞

4.1 母羔手術(shù)前準(zhǔn)備

按照常規(guī)手術(shù)的手術(shù)器械、器具、人員準(zhǔn)備。母羔稱重，做好記錄。再保定于手術(shù)架上，腹部（乳頭與臍之間）剃毛，術(shù)部用75%消毒，注射麻醉藥（陸眠靈）0.015 mL/kg。

4.2 卵母細(xì)胞采集液配制

基礎(chǔ)液為TCM199，采集液為TCM199+0.12mg/mL sodium pyruvate+5%EGS+0.01mg/mLHeparin+5.958mg/mL HEPES+10μL/mLmycillin，0.22μm濾器過濾，38.5℃、5% CO2下過夜平衡。手術(shù)采集卵母細(xì)胞前將采卵液轉(zhuǎn)入50mL離心管，在37℃水浴中預(yù)熱。

4.3 手術(shù)采集卵母細(xì)胞

手術(shù)打開腹腔，做好止血，擴開創(chuàng)口，觀察卵巢位置和超排狀況。用彎頭止血鉗輕輕夾住一側(cè)卵巢韌帶，將卵巢牽拉出體外，關(guān)閉創(chuàng)口，上蓋敷料，將卵巢放于敷料上，用兩個彎頭帶無毒橡膠套的大號彎頭止血鉗夾住卵巢下面的動靜脈血管和韌帶，調(diào)整手術(shù)架高度以便采集卵母細(xì)胞操作。采集人員選擇較舒適姿勢，醫(yī)用10mL注射器先抽取約2mL采卵液，手持10mL注射器，以注射器針頭斜面向下刺入卵泡，同時手指輕輕抽注射器針管，吸取卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞和卵泡液，大卵泡直徑約6mm，小卵泡直徑約2mm?？梢詥蝹€卵泡刺入采集，也可從單個卵泡刺入吸取后再以近水平方向繼續(xù)刺入相鄰卵泡內(nèi)抽吸。卵巢表面大小卵泡都吸取完后，以另一只手拇指食指輕輕捏住卵巢，觸摸卵巢里面手感似米粒的卵泡，再用注射器抽吸采集，直到觸摸不到時為止。抽吸時盡量輕，防止因抽吸太劇烈導(dǎo)致形成裸卵。采集的卵母細(xì)胞液緩慢輕輕注入37℃水浴預(yù)熱的15mL離心管中。采集完的卵巢表明撒止血敏藥粉，再以氯霉素乳膏將整個卵巢包裹，輕輕松開卵巢下方的止血鉗，清創(chuàng)，將卵巢送入腹腔。常規(guī)手術(shù)縫合，肌肉注射陸醒寧0.03mL/kg。采集的卵母細(xì)胞液送入實驗室準(zhǔn)備撿卵。

5 卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)

5.1 卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液準(zhǔn)備

卵母細(xì)胞IVM組成：基礎(chǔ)液+10μg/mLFSH+20μg/mL LH+1μg/mL E2+10 ng/mL EGF+10%EGS+20 ng/mL EGF+ 10μL/mLmycillin等［3］。基礎(chǔ)液：TCM199+0.12mg/mLsodium pyruvate。TCM199按照說明書配制并添加所需組分試劑。FSH、LH、L-glutamine等配制成所需濃度的濃縮儲存液，現(xiàn)用現(xiàn)添加。0.22μm濾器過濾。分別往3個35mm培養(yǎng)液中各加入成熟液2mL，做卵母細(xì)胞洗滌液，并編號；將成熟液加入到四孔板中，每孔600μL成熟液，上覆礦物油，和洗滌液一起在38.5℃、5%CO2下平衡2 h以上。

5.2 撿取卵母細(xì)胞準(zhǔn)備

室溫25～30℃下，將直徑90mm培養(yǎng)皿外部底面用剪刀頭劃出方格，以方便撿取卵母細(xì)胞。將高壓消毒過的巴氏管在酒精燈下拉制成斷端內(nèi)徑250～300μm，在酒精燈火焰下使斷端鈍圓。

5.3 卵母細(xì)胞撿取洗滌分級

在38.5℃加熱板上，將裝有采集卵母細(xì)胞的采卵液靜置8～10min，若采卵液量多，可用注射器輕輕抽出上層液，棄掉。用注射器輕輕抽取底部采卵液，并輕輕注入到90mm培養(yǎng)皿，采卵液量正好平鋪培養(yǎng)皿底部，立體顯微鏡下能清楚觀察到卵母細(xì)胞為宜。將口吸管和巴氏撿卵針相連，調(diào)整立體顯微鏡放大倍率（一般20倍為宜），在立體顯微鏡下從一邊的方格到對側(cè)的方格撿取卵母細(xì)胞。將撿取的卵母細(xì)胞移到1號培養(yǎng)皿洗滌液中。再快速重復(fù)一次，以免有漏掉未撿到的卵母細(xì)胞。最后將盛采卵液的試管用采卵液洗一遍，再撿取卵母細(xì)胞。所以采卵液撿取完畢后，進(jìn)行卵母細(xì)胞洗滌。將1號培養(yǎng)皿洗滌液中的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到2號皿，再從2號皿轉(zhuǎn)移到3號皿中，并按照卵丘顆粒細(xì)胞的多少分級。A級為卵丘細(xì)胞層完整而致密的卵母細(xì)胞；B級為卵丘細(xì)胞層部分脫落的卵母細(xì)胞；C級為卵丘細(xì)胞極少或全部脫落的裸卵。C級淘汰。

5.4 卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)

A級和B級卵母細(xì)胞用于成熟培養(yǎng)。將洗滌好的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到四孔板成熟培養(yǎng)液中，每孔25～30枚卵母細(xì)胞，并緊密放置。將四孔板放入38.5℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，一般成熟培養(yǎng)24～27 h。記錄卵母細(xì)胞入孵培養(yǎng)時間、數(shù)量、所用卵母細(xì)胞母羊號（見附件2）等，四孔板做好標(biāo)注。

6 精子與卵母細(xì)胞體外受精

6.1 受精液配制

配制SOF（見附件3）基礎(chǔ)液，受精液為SOF+1μg/mL hypotaurine+6mg/mLBSA+10μL/mLmycillin等。0.22μm濾器過濾，分別往3個35mm培養(yǎng)液中各加入受精液2mL，做卵母細(xì)胞洗滌液，并編號；四孔板每孔加入受精液400μL，上覆礦物油，38.5℃、5%CO2平衡2 h以上，備用。

6.2 卵母細(xì)胞準(zhǔn)備

室溫25～30℃下，在38.5℃加熱板上，用內(nèi)徑250～300μm撿卵針將成熟培養(yǎng)24～26 h的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1號受精洗滌液中。取1mL受精液加入透明質(zhì)酸酶使?jié)舛葹?%。將受精液中的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入1%透明質(zhì)酸酶液中，作用2～3min，用內(nèi)徑200～250μm撿卵針輕輕反復(fù)吹吸，使顆粒細(xì)胞脫落。再將卵母細(xì)胞依次轉(zhuǎn)移到2號、3號受精洗滌液中，最后轉(zhuǎn)移到四孔板受精液中，每孔25～30枚卵母細(xì)胞。

6.3 精子獲能液配制

配制SOF（見附件3）基礎(chǔ)液，獲能液為：SOF+2% EGS+25μg/mL heparin+10μL/mLmycillin等［4］，0.22μm濾器過濾，38.5℃、5%CO2平衡2 h以上。每支無菌玻璃試管加入獲能液800μL，38.5℃、5%CO2下備用。

6.4 精子獲能處理

38.5 ～40℃水浴中解凍細(xì)管凍精或者顆粒凍精（用無菌預(yù)熱的玻璃試管），檢查精子活力。根據(jù)精子密度，取解凍的精液100～150μL輕輕加入到800μL獲能液玻璃試管底部。38.5℃、5%CO2上浮處理20min，備用。

6.5 精子與卵母細(xì)胞體外受精

室溫25～30℃下，在38.5℃加熱板上，取微量上游獲能處理的上清液顯微鏡下檢查精子活力與密度，確定上清液精子加入量。一般每孔用微量移液槍取120～150μL上清液，顯微鏡下輕輕加入到四孔板卵母細(xì)胞受精液中，觀察精子活動情況，精子應(yīng)該能推動卵母細(xì)胞滾動。記錄受精時的時間、所用卵母細(xì)胞的母羊號、所用精液的公羊號等，四孔板做好標(biāo)注。放入38.5℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22～24 h。

7 早期胚胎體外發(fā)育培養(yǎng)

7.1 發(fā)育培養(yǎng)液配制

配制SOF（見附件3）基礎(chǔ)液，發(fā)育培養(yǎng)液為：SOF+8 mg/mL BSA+2%EAA+1%NAA+10μL/mL mycillin+ 0.5mg/mLmercaptoethanol等［5-6］。0.22μm濾器過濾，分別往3個35mm培養(yǎng)液各加入發(fā)育液2mL，做合子洗滌液，并編號；四孔板每孔加入發(fā)育液600μL，上覆礦物油，38.5℃、5%CO2平衡2 h以上，備用。

7.2 早期胚胎培養(yǎng)

室溫25～30℃下，在38.5℃加熱板上。精子與卵母細(xì)胞作用22～24 h后，用微量移液槍輕輕反復(fù)吹打假定合子，直到假定合子透明帶外粘附的精子凝塊脫落為止。立體顯微鏡下用內(nèi)徑200～250μm撿卵針分別將每孔假定合子轉(zhuǎn)移到胚胎發(fā)育培養(yǎng)液中，再依次轉(zhuǎn)移到2號、3號胚胎發(fā)育液中。立體顯微鏡40倍觀察卵裂情況，并記錄。將卵裂的2細(xì)胞胚胎挑選出來。最后，卵裂的2細(xì)胞胚胎轉(zhuǎn)移到胚胎發(fā)育液四孔板的培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)5～6 h。未卵裂假定合子分別轉(zhuǎn)移到胚胎發(fā)育液四孔板相應(yīng)的培養(yǎng)孔中，38.5℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。記錄培養(yǎng)時間、數(shù)量、羊號等，四孔板做好標(biāo)注。

7.3 早期胚胎觀察

已卵裂的2細(xì)胞胚胎培養(yǎng)5～6 h后，可移植到受體母羊輸卵管中。未卵裂假定合子培養(yǎng)24 h后，立體顯微鏡下觀察卵裂情況。挑選出未卵裂的假定合子，棄掉。2～4細(xì)胞胚胎可以挑選出來，進(jìn)行輸卵管移植；也可繼續(xù)發(fā)育培養(yǎng)24 h后，換液繼續(xù)培養(yǎng)直到發(fā)育至囊胚。換液成分為：SOF+10%EGS+2%EAA+1%NAA+10μL/mL mycillin等。

8 受體母羊同期發(fā)情處理

8.1 受體母羊選擇

受體母羊應(yīng)為年齡3～6歲，上一年度有生產(chǎn)史，發(fā)情正常，膘情適中，體重22.5～35.0 kg的健康經(jīng)產(chǎn)母羊。

8.2 受體母羊同期發(fā)情處理

放置CIDR（新西蘭），母羊外生殖器先用干凈濕抹布擦拭，清除污物，再用酒精棉球擦拭，最后用生理鹽水棉球擦拭，CIDR槍用酒精棉球消毒處理，放置CIDR時槍表面用酒精棉球擦拭消毒，裝入CIDR，一手持槍，一手拇指食指打開生殖器，將CIDR槍輕輕送入，在不損傷母羊生殖道的前提下，盡可能深一些送入，推動槍的頂桿將CIDR頂入母羊生殖道。用酒精棉球擦拭槍表面消毒。放置CIDR第14天下午肌肉注射PMSG 250 IU，第15天上午撤栓，同時肌肉注射PG 1mL，第16、17天上下午用公羊試情。記錄受體羊發(fā)情日期、時間等（見附件4）。受體母羊移植前24 h禁食禁水。

9 胚胎移植

9.1 胚胎與受體母羊匹配

輸卵管移植2～4細(xì)胞胚胎時，受體母羊發(fā)情結(jié)束與2～4細(xì)胞胚胎匹配，或者受體母羊發(fā)情結(jié)束比2～4細(xì)胞胚胎晚12 h。

9.2 胚胎準(zhǔn)備

在受體母羊與胚胎匹配的情況下，受體母羊準(zhǔn)備好手術(shù)移植時，將2～4細(xì)胞胚胎轉(zhuǎn)移出發(fā)育培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入移植液。準(zhǔn)備好移植針（帶注射器）等，移植針可用購買的商品移植針，也可自制，將巴氏管拉制成尖端內(nèi)徑1 mm左右，在酒精燈火焰下使針頭鈍圓即可。需要遠(yuǎn)距離運輸胚胎時，可將胚胎轉(zhuǎn)入到2mL離心管中，放入保溫瓶（37℃）即可。做好無菌措施。

9.3 胚胎裝入移植針

當(dāng)受體母羊黃體良好確認(rèn)移植胚胎時，在立體顯微鏡下，用100μL移液槍將含有胚胎的液體從2mL離心管中移入35mm培養(yǎng)皿，檢查胚胎數(shù)量，確保不丟失胚胎。胚胎裝入移植針時，先吸取一段移植液于移植針中，留一段空氣，再吸取移植液和3～4枚胚胎，留一段空氣，再吸取一段移植液，將含有胚胎的液體置于兩段液體之間。

9.4 胚胎移植

將與胚胎匹配的受體母羊保定于手術(shù)架上，術(shù)部剃毛，酒精消毒，肌肉注射陸眠靈0.015mL/kg。沿腹中線位置，切口皮膚約5 cm，鈍性分離肌肉，剪開腹膜，食指與中指將子宮角牽拉出創(chuàng)口，暴露卵巢觀察黃體情況。優(yōu)良黃體為突出于卵巢表面火山口樣的紅色突起。選擇卵巢有黃體側(cè)進(jìn)行胚胎移植，創(chuàng)口覆蓋敷料，將子宮角、輸卵管等置于其上，尋找輸卵管傘口，可借助蘸有溫生理鹽水的敷料撥動輸卵管傘，將裝有胚胎的移植針頭從輸卵管傘口輕輕送入，濕敷料配合移植針向輸卵管深部送入，移植針頭通過輸卵管2～3個生理彎后，輕輕推動注射器，將胚胎注入到輸卵管中，可看到輸卵管隨著注射器推動而逐漸充盈且向深部充盈，表明胚胎已移植入輸卵管中。在推動注射的同時將移植針緩慢輕輕抽出輸卵管，胚胎移植結(jié)束。同時受體母羊每只肌肉注射黃體酮15mg。清創(chuàng)，受體母羊創(chuàng)口縫合，肌肉注射陸醒寧0.03mL/kg。

10 受體母羊早期妊娠診斷

10.1 血清孕酮檢測

受體母羊胚胎移植45 d左右，采集受體母羊血液，制備血清，檢測血清中孕酮含量。

10.2 B超檢查

受體母羊胚胎移植45 d左右，使用獸用B超，檢查子宮胚胎情況。

附件1 J I VET試驗安排

附件2 JIVET體外受精記錄表

附件3 SOF液成分表（100m L）

附件4受體母羊同期發(fā)情與胎胎移植記錄表

［1］李媛.人類輔助生殖實驗技術(shù)［M］.北京：科學(xué)出版社，2008：42-49.

［2］Andras Nagy，Marina Gertsenstein，Kristina Vintersten，et al. 孫青原，陳大元.主譯.小鼠胚胎操作實驗手冊［M］.3版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006：135-160.

［3］豆興堂，張興會，郭丹，等.影響絨山羊母羔卵母細(xì)胞體外成熟因素的研究［J］.黑龍江動物繁殖，2012，20（1）：12-14.

［4］豆興堂，宋先忱，張興會，等.肝素濃度對遼寧絨山羊精子體外獲能的影響［J］.中國草食動物，2011，31（1）：21-23.

［5］豆興堂，宋先忱，郭丹，等.影響遼寧絨山羊母羔胚胎體外生產(chǎn)因素的研究［J］.中國草食動物，2011，31（6）：21-24.

［6］豆興堂，宋先忱，高月，等.遼寧絨山羊母羔體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)研究［J］.黑龍江動物繁殖，2016，24（5）：9-13.

Procedure for in Vitro Embryo Production of Cashmere Goat

Dou Xingtang
（Institute ofAnimal Husbandry of Liaoning Province，Liaoyang 111000，China）

cashmere goat；doe；in vitro embryo；in vitro fertilization

S827.3

A

2095-3887（2017）01-0019-05

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.01.006

2016-12-08

豆興堂（1978-），男，高級畜牧師，碩士，主要從事絨山羊繁殖育種與胚胎工程技術(shù)研究工作。

Abstrace：This text has given an introduction about the procedures for in vitro embryo production of cashmere goat，including requirement of lab，doe superovulation，sperm treatment，oocyte collection，maturation culture，in vitro fertilization，in vitro embryo culture，embryo transfer and so on，also appended time plan，compounding of SOF culture solution，record list and so on.