陳金娥，李風波，何麗華，沈衛(wèi)鋒

(浙江省農(nóng)業(yè)科學院 蠶桑研究所，浙江 杭州 310021)

一種家蠶后部絲腺高純度線粒體提取方法

陳金娥，李風波，何麗華，沈衛(wèi)鋒

(浙江省農(nóng)業(yè)科學院 蠶桑研究所，浙江 杭州 310021)

為了從家蠶后部絲腺中提取高純度的線粒體，采用差速離心和非連續(xù)Percoll密度梯度離心方法，分離和純化家蠶后部絲腺線粒體，并通過電鏡觀察和蛋白免疫印跡驗證提取效果。結(jié)果表明，采用該方法分離的線粒體雜質(zhì)少、純度高，并且線粒體內(nèi)外膜結(jié)構完整。該研究建立了一種提取家蠶后部絲腺線粒體的方法，為進一步研究線粒體在家蠶后部絲腺中的功能奠定了基礎。

家蠶； 后部絲腺； 線粒體； 純化

線粒體是一種重要的細胞器，是細胞的產(chǎn)能、代謝和凋亡中心，在生命過程中發(fā)揮著重要的生理功能。線粒體除了生產(chǎn)ATP為細胞供能外，還具有組織特異性以適應不同組織的生理需要，在真核生物的生長發(fā)育過程及先天免疫中起重要作用[1-5]。對線粒體結(jié)構與功能的研究通常是在離體的線粒體上進行的，因此從某一組織獲得高純度的線粒體是研究線粒體組織功能的關鍵。家蠶幼蟲絲腺是合成分泌絲蛋白的重要組織器官，其中，后部絲腺是專門分泌絲素蛋白的部分，絲素在蠶絲蛋白中大約占70%～80%，研究后部絲腺的功能對提高蠶絲的品質(zhì)和產(chǎn)量具有重要意義。以往對昆蟲線粒體方面的研究大多只采用差速離心獲得的線粒體[3,6-7]，但是差速離心只能用于分離不同大小、體積和質(zhì)量的細胞器，對于一些相近的細胞器和物質(zhì)則難以去除，如果要深入研究線粒體的功能，則需要獲得高純度線粒體，為此需要進一步的純化。本文介紹了一種聯(lián)合差速離心和密度梯度離心，從家蠶后部絲腺獲得高純度線粒體的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

家蠶p50品種，在標準條件(25 ℃，濕度85%)下催青，用桑葉喂養(yǎng)至5齡第3天。在立體顯微鏡下解剖家蠶幼蟲，取后部絲腺組織，3個重復，每個重復1.2 g組織(10～12條蠶)，用0.9% NaCl清洗3遍。

蔗糖(Sucrose)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、丙烯酰胺(Acrylamide)、甲叉丙烯酰胺(N, N′-Methylene bisacrylamide)均購自Amresco公司；Percoll和Protein marker購自GE公司；細胞色素(Cytochrome)c抗體定制于杭州華安生物技術有限公司；Western及IP細胞裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑均購自碧云天生物公司；蛋白定量試劑盒及其他試劑均購于上海生工生物公司。

1.2 線粒體的分離和純化

線粒體分離和純化參考Alonso等[8]和Sims等[9]的方法有所修改。

在后部絲腺中以1∶10加入STE勻漿緩沖液(100 mmol·L-1Tris，10 mmol·L-1EDTA, 2.5 mol·L-1sucrose，pH值7.4)，冰上放置10 min，用杜恩斯勻漿器的松勻漿棒上下勻漿8次，再用緊勻漿棒上下勻漿10～12次。

把勻漿液移入10 mL離心管中，于4 ℃、1 000g離心10 min，取上清，于4 ℃、10 000g離心10 min，棄上清，沉淀即為粗提的線粒體樣品。

沉淀中加入2 mL 15% Percoll溶液，輕輕吹打，充分混勻。然后沿壁緩慢加到由3 mL 23% Percoll溶液和3 mL 40%的Percoll溶液組成的非連續(xù)Percoll密度梯度中，4 ℃、31 000g離心5 min。

沉淀在Percoll密度梯度中分為3層，線粒體位于23%/40%之間的那一層，小心取出線粒體層并加入10 mL STE溶液進行稀釋。于4 ℃、16 500g離心30 min。棄上清，取沉淀，再加入10 mL STE溶液稀釋，于4 ℃、15 000g離心10 min，沉淀即為純化的線粒體樣品。

1.3 電鏡觀察

在粗提和純化線粒體沉淀中逐滴加入戊二醛固定液浸泡整個沉淀，4 ℃固定過夜；用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(pH值7.4)漂洗3次，每次15 min；用1%鋨酸溶液固定2 h，然后用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液漂洗3次，每次15 min；用梯度溶液(50%、70%、80%和90%丙酮)脫水，每種濃度各處理15 min，再用100%丙酮處理2次，每次15 min；用體積比為2∶1的丙酮與包埋劑浸漬液浸漬4 h，之后用體積比1∶2的丙酮∶包埋劑浸漬液浸漬12 h，再用純包埋液浸漬2次，每次12 h；將樣品放入盛有純包埋劑的包埋板中，將包埋板置于65 ℃各聚合48 h以上；對樣品進行超薄切片，切片厚度70 nm，經(jīng)乙酸雙氧鈾染色10 min后清洗，最后置于透射電子顯微鏡FEItecnai G2 spirit下觀察并拍照。

1.4 免疫蛋白印跡

配制15% SDS-PAGE膠，粗提線粒體樣品和純化線粒體樣品用Western及IP細胞裂解液裂解，蛋白上樣量均為20 μg，于150 V電泳80 min；100 V轉(zhuǎn)膜35 min；5%脫脂牛奶常溫下封閉1 h后，在常溫下孵育一抗(Cytochrome c 抗體1∶2 000稀釋)1 h；TBST洗3次，每次10 min；用5%脫脂奶粉1∶5 000稀釋羊抗鼠HRP，反應體積1 mL，室溫搖床上反應1 h；TBST洗3次，每次10 min；ECL顯影，底物反應3 min曝光(Bio-Rad凝膠成像分析儀)。

2 結(jié)果與分析

2.1 非線性蔗糖密度梯度離心結(jié)果及線粒體得率

組織勻漿液經(jīng)差速離心后獲得后部絲腺粗提線粒體樣品，粗提線粒體樣品經(jīng)Percoll密度梯度離心后，離心管內(nèi)液體明顯分為3層(圖1)。大部分線粒體集中于Percoll非線性密度梯度23%/40%的位置；通過蛋白濃度測定計算，3次重復的線粒體得率分別為78(0.006 5%)、388(0.032%)、280(0.023%)μg。

圖1 非連續(xù)性Percoll密度梯度離心純化線粒體

2.2 透射電子顯微鏡觀察線粒體的純度和完整性

通過透射電鏡觀察粗提線粒體樣品和純化線粒體樣品，發(fā)現(xiàn)經(jīng)密度梯度離心后線粒體明顯被富集，雜質(zhì)明顯減少，并且破損的線粒體也減少；純化后的線粒體結(jié)構完整，包含完整的內(nèi)外膜結(jié)構(圖2)，說明純化效果較好。

圖2 透射電鏡觀察粗提線粒體(A)和純化線粒體(B)

2.3 蛋白免疫印跡檢測線粒體純度

為了進一步檢驗純化效果，用蛋白免疫印跡方法進行了驗證。結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過密度梯度離心后，線粒體明顯被進一步富集。用于檢測的抗體細胞色素c(cytochrome c)位于線粒體內(nèi)膜和外膜的間隙，進一步證明分離到的線粒體內(nèi)外膜結(jié)構的完整性。

圖3 免疫印跡檢測線粒體純度

3 討論

提取純凈并且結(jié)構完好的線粒體是離體線粒體研究工作的必要前提。本文介紹了一種提取家蠶后部絲腺高純度線粒體的方法，該方法不需要太高的離心速度即可實現(xiàn)純化。通過電鏡觀察以及蛋白免疫印跡驗證了分離到的線粒體內(nèi)外膜結(jié)構完整，雜質(zhì)少，并且線粒體得率為0.01%～0.03%，能滿足線粒體相關研究所需的量，證實了該方法的實用性，為家蠶后部絲腺線粒體離體功能測定、線粒體基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的研究奠定了基礎。

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(責任編輯：侯春曉)

2016-11-11

浙江省自然科學基金項目(LY14C170001)；浙江省植物有害生物防控重點實驗室——省部共建國家重點實驗室培育基地項目(2010DS700124-KF1514)

陳金娥(1979—)，女，浙江上虞人，助理研究員，博士，從事家蠶蛋白質(zhì)組學的研究工作，E-mail：chenje79@126.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170249

S881.2

A

0528-9017(2017)02-0347-02

文獻著錄格式：陳金娥，李風波，何麗華，等. 一種家蠶后部絲腺高純度線粒體提取方法[J].浙江農(nóng)業(yè)科學，2017，58(2)：347-348，352.