陳興林，俞 露，黃建敏

(1.貴州省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，貴州 貴陽(yáng) 550012； 2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

風(fēng)味水豆豉發(fā)酵菌種的篩選與鑒定

陳興林1，俞 露2*，黃建敏2

(1.貴州省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，貴州 貴陽(yáng) 550012； 2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

為給貴州省風(fēng)味水豆豉工業(yè)化生產(chǎn)提供可選的生產(chǎn)菌株，從傳統(tǒng)發(fā)酵的細(xì)菌型水豆豉中分離篩選適于豆豉生產(chǎn)的菌種，并對(duì)分離出的優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行產(chǎn)氣篩選，優(yōu)選出不產(chǎn)氣的3株優(yōu)勢(shì)菌株，經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)3株菌株均為枯草芽孢桿菌。

水豆豉； 發(fā)酵； 菌種； PCR； 鑒定

豆豉古名“幽菽”，古代稱大豆為“菽”，“幽”是指把大豆煮熟后幽閉發(fā)酵的意思[1]，至秦朝始更名為豆豉。豆豉是以黃豆為原料，經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵制得的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，味道鮮美，既能調(diào)味又能入藥，長(zhǎng)期食用可開胃增食、祛風(fēng)散寒、消積化滯[2]。豆豉發(fā)酵中微生物起著至關(guān)重要的作用，孫森等[3]對(duì)天然制曲豆豉發(fā)酵過(guò)程中菌相的變化進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，優(yōu)勢(shì)菌群為乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌。

水豆豉是細(xì)菌型豆豉，是由黃豆經(jīng)過(guò)細(xì)菌作用發(fā)酵而成的釀造調(diào)味食品，因含水量大，故產(chǎn)品呈濕態(tài)，在堆積發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生水解作用產(chǎn)生一些特殊氣味[4]。水豆豉營(yíng)養(yǎng)豐富，含有豐富的蛋白質(zhì)，維生素和礦物質(zhì)[4-7]。日本的“納豆”與我國(guó)的水豆豉是相似的發(fā)酵食品，它最早是在唐朝由鑒真和尚帶到日本的。豆豉起源于民間，植根于民間，發(fā)展于民間，它以特殊的工藝、豐富的營(yíng)養(yǎng)、獨(dú)特的風(fēng)味深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)，并越來(lái)越受到人們的重視。

鄯晉曉等[2]研究表明，細(xì)菌型豆豉中的主要菌種為枯草芽孢桿菌，它能形成大量淀粉酶和蛋白酶，是細(xì)菌型豆豉發(fā)酵中必不可少的菌種。張建華[8]對(duì)自然發(fā)酵曲霉型豆豉曲中微生物的分布進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，自然發(fā)酵豆豉中主要的微生物菌群是細(xì)菌和霉菌。蔣立文等[9]利用平板稀釋分離方法，確定了瀏陽(yáng)豆豉制曲中主要微生物是霉菌類和細(xì)菌類。

本文對(duì)貴州細(xì)菌型水豆豉中的優(yōu)勢(shì)發(fā)酵菌群進(jìn)行了分離、篩選和鑒定，以期為后續(xù)的菌粉制備和發(fā)酵工藝等方面的深入研究提供一定的理論基礎(chǔ)，為貴州省水豆豉產(chǎn)品的工業(yè)化和產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

水豆豉，貴州水巷子食品有限公司生產(chǎn)；納豆菌粉，北京川秀科技有限公司；黃豆、食鹽、姜、辣椒、花椒、土豆、西紅柿、面粉均采購(gòu)自貴陽(yáng)市花溪合力超市。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離純化

用滅菌后的玻璃瓶從發(fā)酵車間分別采集發(fā)酵半成品樣品各500 g(發(fā)酵0、6、12、24、48 h)，采用稀釋涂布分離法進(jìn)行分離。分別稱取25 g豆豉樣品，無(wú)菌操作移入225 mL滅菌0.9% NaCl中，然后依次進(jìn)行梯度稀釋(梯度稀釋為10-4、10-5、10-6、10-7、10-8和10-9)，再選擇適宜的稀釋度，取200 μL涂布于PAD、NB和MRS平板上。每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行。經(jīng)培養(yǎng)后，挑取不同形態(tài)的單菌落，經(jīng)多次劃線純化后得到純菌株，再觀察菌落形態(tài)和菌體形態(tài)，選擇具有代表性的菌株進(jìn)行生理生化鑒定試驗(yàn)。

1.2.2 菌株的鑒定

菌體形態(tài)特征。將菌體進(jìn)行革蘭氏染色，用顯微鏡觀察個(gè)體形態(tài)，并用目鏡測(cè)微尺測(cè)量菌體大小。

菌落形態(tài)鑒定。將分離菌株點(diǎn)種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)1 d，形成菌落，觀察菌落的大小、質(zhì)地、形狀等。

生理生化鑒定。通過(guò)糖類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)等，進(jìn)行生理生化鑒定，參照《伯杰士鑒定手冊(cè)》(第八版)鑒定到種屬。

分子生物學(xué)鑒定。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根)提取基因組DNA，然后，以基因組DNA為模板，用特異性引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA序列，PCR引物序列5′-GAGGAACATCAGTGGCGA AGG-3′、5′-CCAGGCGGCGAACTTAACG-3′。反應(yīng)體系40 μL，包括rTaq酶(含buffer)20 μL，DNA模板4 μL(100 ng)，上、下游引物(10 mmol·L-1)各0.8 μL，ddH2O 14.4 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。

16S rDNA序列檢測(cè)。取10 μL 16S rDNA PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠，100 V電泳40 min檢測(cè)后，剩余的PCR產(chǎn)物送英駿檢測(cè)中心測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株

在選擇性分離PAD、NB和MRS平板上，僅MRS平板出現(xiàn)菌落生長(zhǎng)，分離純化得到4株菌株，并命名為A1、A2、A3、A4。

2.2 菌體、菌落形態(tài)

菌株A1為革蘭氏陰性菌，呈桿狀，形狀不規(guī)則，中端孢生，菌落呈乳白色，菌落表面邊緣干燥，菌落直徑2.6 mm。菌株A2為革蘭氏陰性菌，呈短桿狀，形狀為圓形或不規(guī)則，菌落呈乳白色，菌落表面濕潤(rùn)，菌落直徑3.0 mm。菌株A3為革蘭氏陰性菌，呈桿狀，形狀為圓形，中端孢生，菌落呈乳白色，菌落表面邊緣濕潤(rùn)，菌落直徑3.8 mm。菌株A4為革蘭氏陰性菌，呈桿狀，形狀為圓形或橢圓形，菌落呈粉紅色，菌落表面邊緣干燥，菌落直徑1.8 mm。菌體菌落形態(tài)見圖1、圖2。

圖1 各菌株菌落的形態(tài)

圖2 各菌株菌體的形態(tài)

2.3 生理生化

以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)為對(duì)照菌種，對(duì)上述菌種進(jìn)行部分生理生化特征的測(cè)定以及糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，生理生化實(shí)驗(yàn)包括V-P測(cè)定、吲哚實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)，結(jié)果(表1)表明，A3號(hào)菌種與參照菌種的生理生化特征相似。根據(jù)參考文獻(xiàn)[10-11]，初步確定4株菌種均為枯草芽孢桿菌屬。同時(shí)還做了產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)A4號(hào)菌株有產(chǎn)氣現(xiàn)象，不適合在實(shí)際生產(chǎn)中運(yùn)用。

表1 各菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：+表示陽(yáng)性，-表示陰性。

2.4 分子生物學(xué)

在NCBI網(wǎng)站中使用blast在Genebank/EMBL/DDBJ基因庫(kù)中，將獲得的16S rDNA序列進(jìn)行同源性搜索。結(jié)果表明，A1、A2、A3菌株的16S rDNA序列分別與枯草芽抱桿菌Bacillussubtilis168、BacillusvelezensisFZB42、Bacillusatrophaeus1942的16S rDNA序列同源性高達(dá)99%(表2)，表明A1、A2和A3菌株均為枯草芽孢桿菌。

表2 Genebank中各菌株16S rDNA序列

3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)以貴州省風(fēng)味水豆豉為材料，通過(guò)分離純化得到4株優(yōu)勢(shì)菌株，并命名為A1、A2、A3、A4。從菌落的形態(tài)上看，菌株呈乳白色或粉紅色，圓形或不規(guī)則，屬于枯草芽孢桿菌。通過(guò)生理生化實(shí)驗(yàn)，初步確定4株菌株為枯草芽孢桿菌屬，4號(hào)菌株有產(chǎn)氣現(xiàn)象，會(huì)對(duì)產(chǎn)品的貯藏造成不利的影響，不適合在實(shí)際生產(chǎn)中運(yùn)用。再對(duì)不產(chǎn)氣的3株菌株進(jìn)行基因組DNA的提取純化及16S rDNA序列分析，結(jié)果表明，A1、A2和A3菌株均為枯草芽孢桿菌。

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(責(zé)任編輯：侯春曉)

2016-10-20

風(fēng)味水豆豉加工關(guān)鍵技術(shù)研究(黔科合NY字[2012]3075號(hào))

陳興林(1966—)，男，貴州貴陽(yáng)人，實(shí)驗(yàn)師，本科，從事食品質(zhì)量安全檢測(cè)工作，E-mail: 441977669@qq.com。

俞 露(1982—)，女，浙江德清人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事果蔬貯藏與加工研究工作，E-mail:yuji570@163.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170229

TS214.9

A

0528-9017(2017)02-0275-02

文獻(xiàn)著錄格式：陳興林，俞露，黃建敏. 風(fēng)味水豆豉發(fā)酵菌種的篩選與鑒定[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(2)：275-276，279.