陶玉芬, 劉 波, 李 超, 李昕潼, 劉建生, 楊昭慶，劉紅旗

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118)

阿司匹林誘導(dǎo)EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞凋亡

陶玉芬, 劉 波, 李 超, 李昕潼, 劉建生, 楊昭慶，劉紅旗

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118)

目的 探討阿司匹林誘導(dǎo)EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞凋亡及其機(jī)制。方法 EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞經(jīng)一定濃度的阿司匹林處理后，首先通過MTT法分析細(xì)胞的增殖情況；然后用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡、PI染色和流式細(xì)胞術(shù)分析以及瓊脂糖凝膠電泳等方法對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行評(píng)價(jià)；最后，通過免疫印記法檢測凋亡相關(guān)蛋白、mTOR信號(hào)通路和PU.1-Bim信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 阿司匹林能抑制EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞增殖。形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，阿司匹林處理的細(xì)胞固縮變小、數(shù)目減少、細(xì)胞核畸形、染色質(zhì)邊緣化和細(xì)胞質(zhì)空泡化。阿司匹林處理導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加、細(xì)胞存活率明顯下降和細(xì)胞DNA的彌散現(xiàn)象。免疫印跡分析顯示，阿司匹林處理抑制了細(xì)胞的mTOR信號(hào)和轉(zhuǎn)錄因子PU.1的表達(dá)水平，激活了細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、PARP和Bim。結(jié)論 阿司匹林可能通過抑制EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡表現(xiàn)一定的抗淋巴瘤效應(yīng)，mTOR信號(hào)途徑和PU.1-Bim軸可能參與了阿司匹林抗腫瘤作用機(jī)制。

阿司匹林；EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞; 凋亡；mTOR; PU.1-Bim軸；抗腫瘤

Epstein-Barr病毒(EB病毒)是一種γ亞科皰疹病毒，其感染可能導(dǎo)致人類多種惡性疾病，尤其是上皮和淋巴起源的腫瘤，如Burkitt淋巴瘤、霍奇金病、鼻咽癌等[1]。EB病毒對(duì)人B細(xì)胞具有親嗜性。一般認(rèn)為，EB病毒在體外可以感染靜息人B淋巴細(xì)胞，使其發(fā)生轉(zhuǎn)化，形成永生化淋巴細(xì)胞株(LCL)。EB病毒轉(zhuǎn)化人B淋巴細(xì)胞，其方法成熟、簡單、可行性強(qiáng)，且實(shí)驗(yàn)材料易得，為生物醫(yī)學(xué)研究提供了無限的寶貴資源[2]。EB病毒轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞，一方面具有B淋巴細(xì)胞特性，可用于免疫學(xué)方面的研究；另一方面又具有腫瘤細(xì)胞的某些特點(diǎn)，可作為腫瘤治療的藥物篩選模型及機(jī)制研究等。

阿司匹林(aspirin)又名乙酰水楊酸(acetylsalicylic acid，ASA)，是非甾體類抗炎藥的成員之一。阿司匹林自誕生之初，因其比較廉價(jià)且容易獲得，應(yīng)用已達(dá)百余年，是目前在臨床上應(yīng)用得最為成功和最為廣泛的化學(xué)合成藥物之一。從最初的解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎，到心血管疾病的預(yù)防和治療，以及近年來發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤作用，阿司匹林均顯示了廣闊的應(yīng)用前景。阿司匹林的抗腫瘤作用越來越受到醫(yī)生和科學(xué)家們的關(guān)注。流行病學(xué)和臨床應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林的使用與某些腫瘤的發(fā)生率下降[3]、病人生存時(shí)間的延長可能有很大的相關(guān)性，阿司匹林可能作為腫瘤治療的一種輔助治療。目前，阿司匹林抗腫瘤的可能機(jī)制主要涉及3條途徑：血小板途徑、環(huán)氧酶依賴途徑和環(huán)氧酶非依賴途徑[4]。然而，參與阿司匹林抗腫瘤的信號(hào)途徑和分子機(jī)制還不是很清楚。

本研究首次利用EBV轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞作為研究對(duì)象，探索阿司匹林的抗腫瘤機(jī)制。結(jié)果表明，阿司匹林通過抑制EBV轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡表現(xiàn)其抗腫瘤作用。mTOR信號(hào)和PU.1-Bim軸可能參與阿司匹林誘導(dǎo)EBV轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞的凋亡。這些發(fā)現(xiàn)為阿司匹林的臨床應(yīng)用提供了一定的理論參考。

1 材料與儀器

1.1 藥物與試劑 EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞來自中國不同民族永生化細(xì)胞庫(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所醫(yī)學(xué)遺傳室)。阿司匹林購自Cayman Chemical公司；MTT購自Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自Cellgro公司；胎牛血清、谷氨酰胺和雙抗購自Bioind公司；PI購自Invitrogen公司；抗體S6購自Santa Cruz公司；抗體caspase-3、β-actin、pS6、PU.1、Bim、二抗Anti-rabbit IgG和Anti-mouse IgG均購自Cell Signaling Technology公司；BCA蛋白定量分析試劑盒購自Thermo公司；ECL免疫印跡底物(PierceTMECL Plus Western Blotting Substrate)購自Thermo公司。

1.2 儀器 Tecan infinite M200 pro酶標(biāo)儀(型號(hào)1208007652)購自Tecan公司；高速冷凍離心機(jī)(型號(hào)5430R)購自德國Eppendorf公司；凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)1702820)購自BIORAD公司；Mini-PROTEAN?Tetra電泳槽(型號(hào)165-8004)購自BIORAD公司；細(xì)胞離心涂片機(jī)(型號(hào)Shandon Cytospin 4)購自Thermo公司；制冰機(jī)(型號(hào)SIM-F140AY65)購自SANYO公司；XCell IITM Bolt Module 蛋白印跡系統(tǒng)(型號(hào)EI9014)購自Invitrogen公司；BD Biosciences FACS Calibur流式細(xì)胞儀購自BD公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和溶液配制 EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)基為RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1%鏈霉素、1%青霉素和1%谷胺酰胺)。細(xì)胞在 37℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。阿司匹林用無水乙醇配制成400 mmol·L-1的儲(chǔ)存液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖 細(xì)胞經(jīng)阿司匹林處理后，取100 μL細(xì)胞懸液于96孔板中，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每孔加入10 μL MTT吹打均勻，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后，每孔再加入110 μL鹽酸異丙醇，充分吹打溶解沉淀，于37℃恒溫箱培養(yǎng)45 min。用酶標(biāo)儀于波長570 nm測定OD值。OD 值越高說明生成的沉淀越多，細(xì)胞增殖越強(qiáng)。

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞經(jīng)阿司匹林處理48 h后，取200 μL細(xì)胞懸液放入細(xì)胞離心涂片機(jī)的細(xì)胞漏斗中，于800 ×g轉(zhuǎn)速離心5 min后，置倒置光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。

2.4 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 細(xì)胞經(jīng)阿司匹林處理48 h后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，于4℃、710×g離心5 min。棄上清，細(xì)胞沉淀經(jīng)過固定、脫水、包埋和切片處理后，置透射電子顯微鏡觀察。

2.5 碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色和流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞存活率 細(xì)胞經(jīng)阿司匹林處理后，分別在0、24、48、72 h取500 μL細(xì)胞懸液入流式管中，加入1 μL PI染料輕輕混勻，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。每個(gè)樣品收集3次數(shù)據(jù)，每次收集細(xì)胞數(shù)目為20 000個(gè)。取3次結(jié)果的平均數(shù)進(jìn)行分析。

2.6 檢測細(xì)胞凋亡DNA變化 細(xì)胞經(jīng)阿司匹林處理24 h后，離心收集細(xì)胞(4℃、710×g離心5 min)。加入500～600 μL裂解緩沖液吹打懸浮細(xì)胞，加入RNase A (終濃度為100 g·L-1)，于37℃孵育1 h，去除RNA。然后依次加入等體積量的苯酚、三氯甲烷和異戊醇(25 ∶24 ∶1)、三氯甲烷和異戊醇(24 ∶1)進(jìn)行抽提和去除蛋白質(zhì)。加入5.0 mol·L-1NaCl(終濃度為300 mmol·L-1)和2.5倍體積的100%乙醇后，于-20℃過夜沉淀DNA。次日，12 000×g離心30 min，用70%乙醇除去多余的鹽。純化的DNA用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

2.7 免疫印跡法檢測蛋白表達(dá) 細(xì)胞經(jīng)阿司匹林處理24 h后，收集于15 mL離心管中，于4℃、710×g離心5 min，棄上清；用1 mL預(yù)冷的1×PBS重新懸浮細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL微量離心管中，于4℃、2 000×g離心3 min，棄上清；加入50～70 μL RIPA蛋白裂解液(含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)，于冰浴上進(jìn)行30 min細(xì)胞裂解。用超聲粉碎機(jī)于10%功率超聲15 s。再于4℃、12 000×g離心10 min，將上清蛋白裂解液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL管。通過BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)所測各組樣品的蛋白濃度，用RIPA蛋白裂解液將蛋白樣品稀釋成統(tǒng)一濃度(5 g·L-1)，加入6×loading buffer(含β-巰基乙醇，V/V5‰)混合均勻，振蕩并瞬時(shí)離心。100℃煮沸5 min后用于實(shí)驗(yàn)或-80℃保存?zhèn)溆?。各樣品取等量的蛋白?jīng)12%的SDS-PAGE膠電泳分離后，于45 V轉(zhuǎn)膜1 h或7 V轉(zhuǎn)膜過夜。膜經(jīng)封閉后，加一抗(1 ∶1 000)于4°C過夜孵育。加二抗(1 ∶5 000)后于常溫孵育2.5 h。ECL顯色后,通過Biorad Image Lab照相和分析結(jié)果。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)利用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(t檢驗(yàn)，paired test和two-tailed)。流式細(xì)胞分析結(jié)果用Flowing software 2進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 阿司匹林抑制EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞增殖 為了探索阿司匹林處理對(duì)EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞的影響，首先通過MTT法分析了阿司匹林處理后該細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果表明，2.5、5.0 mmol·L-1的阿司匹林處理EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞后，能明顯抑制該細(xì)胞的增殖。與2.5 mmol·L-1相比，5.0 mmol·L-1的阿司匹林可能還能殺死細(xì)胞，使細(xì)胞增殖下降至基線水平之下(Fig 1)。

3.2 阿司匹林誘導(dǎo)EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞凋亡 為評(píng)價(jià)阿司匹林處理誘導(dǎo)EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞凋亡效應(yīng)，我們首先通過普通光學(xué)顯微鏡觀察阿司匹林處理后細(xì)胞形態(tài)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿司匹林處理導(dǎo)致細(xì)胞的數(shù)目減少，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)皺縮、固化和變小(Fig 2A)。電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，阿司匹林處理還導(dǎo)致細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，包括細(xì)胞核形態(tài)的變化、染色質(zhì)濃縮和細(xì)胞質(zhì)空泡化等現(xiàn)象(Fig 2B)。進(jìn)一步的PI染色和流式細(xì)胞分析結(jié)果表明，阿司匹林處理也導(dǎo)致EB病毒轉(zhuǎn)化人B淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞存活率降低(Fig 2C)。接下來，我們又通過免疫印跡法分析了阿司匹林處理后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果表明，阿司匹林處理激活了EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞的天冬氨酸蛋白水解酶caspase-3和DNA修復(fù)酶PARP(Fig 2D)。最后，2%瓊脂糖凝膠電泳分析細(xì)胞DNA結(jié)果表明，5.0 mmol·L-1阿司匹林處理24 h后，能引起細(xì)胞DNA明顯的彌散現(xiàn)象(Fig 2E)。

Fig 1 Aspirin treatment inhibited proliferation of EBV-transformed human B lymphocytes

*P<0.05,**P<0.01vsethanol group;##P<0.01vs2.5 mmol·L-1ASA group

3.3 阿司匹林處理對(duì)細(xì)胞mTOR信號(hào)和PU.1-Bim軸的影響 為了進(jìn)一步探討阿司匹林處理誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，我們通過免疫印跡法首先分析了阿司匹林對(duì)細(xì)胞mTOR信號(hào)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2.5、5.0 mmol·L-1阿司匹林處理EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞，均能抑制細(xì)胞S6K1和S6蛋白磷酸化水平(T389和pS6)(Fig 3A)，這提示阿司匹林處理抑制了細(xì)胞的mTOR信號(hào)。此外，免疫印跡結(jié)果還顯示，阿司匹林處理抑制造血系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄因子PU.1的蛋白表達(dá)水平，誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bim的表達(dá)(Fig 3B)，這提示PU.1-Bim軸可能與阿司匹林誘導(dǎo)EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞的凋亡相關(guān)。

3.4 Rapamycin和阿司匹林聯(lián)合用藥對(duì)EBV轉(zhuǎn)化人B淋巴細(xì)胞的協(xié)同效應(yīng) 前面的結(jié)果已表明，mTOR可能參與阿司匹林誘導(dǎo)EBV轉(zhuǎn)化人B淋巴細(xì)胞凋亡。這促使我們提出了一個(gè)假說：聯(lián)合mTOR抑制劑和阿司匹林是否可以產(chǎn)生協(xié)同作用？為了驗(yàn)證這一假說，我們用不同濃度的mTOR抑制劑Rapamycin和不同濃度的阿司匹林聯(lián)合處理EBV轉(zhuǎn)化人B淋巴細(xì)胞24 h后，通過MTT法分析藥物處理對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，如果聯(lián)合用藥處理，2.5 mmol·L-1阿司匹林和2.5 μmol·L-1的Rapamycin就能產(chǎn)生比單獨(dú)應(yīng)用10 μmol·L-1的Rapamycin還強(qiáng)的細(xì)胞增殖抑制作用(Fig 4)。這一研究結(jié)果也進(jìn)一步表明，mTOR信號(hào)途徑可能參與阿司匹林誘導(dǎo)EBV轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞的增殖抑制作用。

4 討論

EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞不僅能作為人類遺傳資源的一種保存方法[5]，它還是研究細(xì)胞凋亡和抗腫瘤藥物很好的細(xì)胞模型[6]。本研究利用EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞所建立的細(xì)胞系，首次探討阿司匹林抗腫瘤的分子機(jī)制。結(jié)果表明，阿司匹林通過抑制EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡表現(xiàn)其抗腫瘤作用，mTOR信號(hào)和PU.1-Bim軸可能參與阿司匹林誘導(dǎo)EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞凋亡。聯(lián)合mTOR信號(hào)抑制劑和阿司匹林處理EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生一定的協(xié)同效應(yīng)，有望降低藥物的毒副作用。

阿司匹林的臨床藥理作用通常認(rèn)為是鎮(zhèn)痛、解熱、抗炎以及抗血栓等，認(rèn)為主要是通過抑制COX-2酶活性和影響血小板的形成等機(jī)制。近來，大量的流行病學(xué)和臨床研究表明，阿司匹林的使用能降低腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)性，對(duì)腫瘤的發(fā)生有一定的預(yù)防作用[7-8]。另外，阿司匹林在腫瘤治療方面還起一定的佐劑效應(yīng)，能改善病程[9]。由于阿司匹林還沒有被批準(zhǔn)作為臨床抗腫瘤藥物，因此這些報(bào)道中阿司匹林的使用劑量都是按照抗心血管疾病的用量。體外抗腫瘤作用研究表明，阿司匹林對(duì)肺腺癌SPCA-1 細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用, 表現(xiàn)為SPCA-1細(xì)胞的G0/G1期和G2/M期比例明顯升高, S期比例下降以及凋亡細(xì)胞增多[10]。本研究結(jié)果表明，5.0 mmol·L-1阿司匹林就能明顯抑制EB病毒轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。不同的細(xì)胞對(duì)阿司匹林處理的敏感性不一樣，對(duì)于神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，5.0 mmol·L-1阿司匹林處理72 h后才表現(xiàn)明顯的抑制作用[11]。然而，對(duì)于人膠質(zhì)瘤細(xì)胞，8.0 mmol·L-1的阿司匹林才抑制細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。本研究中的阿司匹林作用動(dòng)態(tài)結(jié)果表明，5.0 mmol·L-1的阿司匹林處理EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞后24 h就出現(xiàn)明顯的抑制效應(yīng)。

Fig 2 Aspirin treatment induced apoptosis in EBV-transformed human B lymphocytes

A: The morphology of aspirin-treated EBV-transformed human B lymphocytes. Figures in each column randomly created from three different fields;B: Ultramicroscopic structure of human B lymphocytes treated by aspirin. Figures in each row randomly created from three different fields;C:Viability of aspirin-treated EBV-transformed B lymphocytes by flow cytometric analysis; D: Expression of apoptosis-associated proteins in aspirin-treated EBV-transformed human B lymphocytes; E: Detection of DNA smear via agarose electrophoresis.△△P<0.01vsNon group;**P<0.01vsethanol group;##P<0.01vs2.5 mmol·L-1ASA group

本研究選用EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞作為細(xì)胞模型的意義在于：首先，該細(xì)胞可以作為造血系統(tǒng)異常相關(guān)的淋巴瘤模型，而PU.1是一個(gè)起多重作用的造血系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄因子[13]，它可以通過結(jié)合到促凋亡蛋白Bim的啟動(dòng)子上，調(diào)節(jié)該蛋白的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞的生長[14]；其次，EB病毒感染通過改變細(xì)胞的多個(gè)信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞生長和永生化，如EBV感染抑制了促凋亡蛋白Bim的表達(dá)[15]，從而使細(xì)胞具有抗凋亡作用而永生化成為細(xì)胞系；EBV的LMP2A蛋白通過激活mTOR信號(hào)調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞的生長[16]。因此，本文就選用mTOR信號(hào)通路和PU.1-Bim作為阿司匹林抗腫瘤的研究靶點(diǎn)。阿司匹林處理抑制了細(xì)胞蛋白S6K1和S6的磷酸化水平，這顯示阿司匹林能抑制EBV轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞的mTOR信號(hào)途徑，可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)。同時(shí)本研究也揭示，阿司匹林處理能降低PU.1的蛋白表達(dá)水平，誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bim的表達(dá)，提示PU.1-Bim軸可能參與阿司匹林誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。據(jù)我們所知，本研究是首次發(fā)現(xiàn)阿司匹林處理抑制EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞的mTOR信號(hào)和轉(zhuǎn)錄因子PU.1的表達(dá)，并促進(jìn)促凋亡蛋白Bim激活，從而誘導(dǎo)EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞凋亡。然而，PU.1-Bim軸對(duì)于阿司匹林誘導(dǎo)EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞凋亡是否是必需的，還有待進(jìn)一步研究。

Fig 3 mTOR signal pathway and PU.1-Bim axis in EBV-transformed human B lymphocytes treated by aspirin Western blot was used to evaluate expression levels of proteins in mTOR signaling pathway(A) and PU.1-Bim axis(B) in aspirin-treated EBV-transformed human B lymphocytes.

Fig 4 Effects of combination of aspirin and rapamycin on proliferation of EBV-transformed human B cells

*P<0.05,**P<0.01vs2.5 mmol·L-1ASA+2.5 μmol·L-1rapamycin group

(致謝：本研究所有實(shí)驗(yàn)均在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所感染與免疫研究室完成，感謝科室所有老師和同學(xué)的幫助和支持！)

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Mechanisms of aspirin-induced apoptosis in EBV-transformed human B lymphocytes

TAO Yu-fen, LIU Bo, LI Chao, LI Xin-tong, LIU Jian-sheng, YANG Zhao-qing, LIU Hong-qi

(InstituteofMedicalBiology,ChineseAcademyofMedicalScience&PekingUnionMedicalCollege,Kunming650118,China)

Aim To investigate the effects of aspirin on Epstein-Barr virus(EBV)-transformed human B-lymphocytes. Methods EBV-transformed human B-lymphocytes were treated with certain concentrations of aspirin. Cellular proliferation was analyzed by MTT assay. Further evaluation of apoptosis of aspirin-treated cells was performed through light-field microscope, transmission electronic microscope(TEM), propidium iodide(PI) staining and flow cytometric analysis and DNA electrophoresis. Finally, immunoblot analysis was used to determine the expression levels of apoptosis-associated proteins, proteins involved in mTOR pathway and PU.1-Bim axis.Results Aspirin treatment inhibited proliferation of EBV-transformed human B-lymphocytes. We observed that aspirin treatment induced apoptosis in EBV-transformed human B-lymphocytes, resulting in the decreased number and size of cells. Ultramicroscopic structural analysis via TEM indicated that aspirin treatment deformed the cellular nucleus, and led to peripheral chromatin and cytoplasmic vacuole. PI staining and flow cytometric analysis indicated that aspirin increased the permeability of cell membrane and decreased the viability of treated cells. Agarose electrophoresis revealed DNA smear in aspirin-treated cells. Mechanistically, mTOR signaling was inhibited in aspirin-treated cells, as evidenced by the decreased phosphorylation of S6K1 and S6 via immunoblot analysis. Aspirin treatment led to the decrease of hematopoietic transcription factor PU.1.Consequently, pro-apoptotic Bim, apoptosis-associated proteins caspase-3 and PARP were activated in aspirin-treated cells.Conclusion Aspirin may show anti-lymphoma effects via its inhibition of proliferation and induction of apoptosis of EBV-transformed human B-lymphocytes, in which mTOR signal pathway and PU.1-Bim axis may be involved.

aspirin; EBV-transformed human B-lymphocytes; apoptosis; mTOR; PU.1-Bim axis；anti-tumor

時(shí)間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.018.html

2016-11-15,

2016-12-17

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81571549)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(No 2013FZ143)；云南省重點(diǎn)新產(chǎn)品開發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目(No 2016BC004)；醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所重點(diǎn)項(xiàng)目(No 2014IMB03ZD)

陶玉芬(1974-)，女，碩士，研究方向：炎癥、感染和免疫學(xué)，E-mail:taoyufen@imbcams.com.cn； 劉紅旗(1973-)，男，博士，副研究員，研究方向：炎癥、感染和免疫學(xué)，通訊作者，E-mail: lhq@imbcams.com.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.009

A

1001-1978(2017)02-0185-06

R331.125；R329.25；R373；R979.1