邵 英，王東旭，陳前昭，曾于樺，周林云，周 益，任文艷，何百成

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室,2.重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

TGF-β3與熊果酸抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖作用的研究

邵 英1,2，王東旭1,2，陳前昭1,2，曾于樺1,2，周林云1,2，周 益1,2，任文艷1,2，何百成1,2

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室,2.重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

目的 研究TGF-β3與熊果酸(ursolic acid, UA)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖作用的關(guān)系及可能的分子機(jī)制。方法 采用結(jié)晶紫染色法和流式細(xì)胞術(shù)分析不同濃度UA對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的作用。利用Western blot和流式細(xì)胞術(shù)等方法分析UA對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響。通過(guò)RT-PCR和(或)Western blot實(shí)驗(yàn)分析UA在HCT116細(xì)胞中對(duì)TGF-β3、Smad2/3和β-catenin表達(dá)及磷酸化水平的影響。采用TGF-β3重組腺病毒和特異性抑制劑以及螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒分析TGF-β3介導(dǎo)UA抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的可能分子機(jī)制。結(jié)果 UA能明顯抑制HCT116細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)G1期阻滯，并促進(jìn)其凋亡。UA能明顯降低TGF-β3的mRNA和蛋白表達(dá)水平；UA對(duì)Smad2/3的總蛋白水平無(wú)明顯影響，但能明顯降低Smad2/3的磷酸化水平；外源性過(guò)表達(dá)TGF-β3可部分逆轉(zhuǎn)UA對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的抑制作用，TGF-β3特異性抑制劑則增強(qiáng)UA對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的抑制作用；UA降低β-catenin蛋白水平，并明顯抑制Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；外源性過(guò)表達(dá)TGF-β3促進(jìn)β-catenin蛋白表達(dá)，并部分逆轉(zhuǎn)UA對(duì)β-catenin蛋白表達(dá)的抑制效應(yīng)；TGF-β3特異性抑制劑增強(qiáng)UA對(duì)β-catenin蛋白表達(dá)的抑制作用。結(jié)論 UA能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖并誘導(dǎo)凋亡，其作用可能是通過(guò)下調(diào)TGF-β3表達(dá)，進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

熊果酸；結(jié)腸癌；增殖抑制；凋亡；TGF-β3；Wnt/β-catenin

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)的惡性腫瘤之一[1]，目前治療所面臨的主要困難在于常用化療藥物的不良反應(yīng)嚴(yán)重和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。雖然近年來(lái)對(duì)結(jié)腸癌診斷和治療技術(shù)有了一定的進(jìn)展，但預(yù)后仍不理想。因此，臨床仍需研發(fā)高效而低毒的藥物用于治療結(jié)腸癌。

熊果酸(ursolic acid ,UA)是從傳統(tǒng)中草藥中提取出的一種五環(huán)三萜類(lèi)化合物，具有多種藥理活性，如鎮(zhèn)靜、抗炎、抗菌、降糖和抗?jié)兊萚2]。近年來(lái)，UA因具有明顯的抗腫瘤活性而備受關(guān)注[3]。文獻(xiàn)報(bào)道，UA的抗腫瘤作用可能與抑制STAT3/COX-2、NF-κB、Wnt/β-catenin信號(hào)[4-7]，激活p53有關(guān)[8]，但具體分子機(jī)制目前仍然不清楚。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)對(duì)細(xì)胞的增殖與分化、胚胎發(fā)育以及血管生成等多種生理過(guò)程有重要的調(diào)控作用。TGF-β有3種亞型，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，三者均在結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)。研究表明，TGF-β3在腫瘤組織中呈明顯異常高表達(dá)[9]。TGF-β信號(hào)與Wnt/β-catenin信號(hào)之間存在cross-talk[10]， Wnt/β-catenin信號(hào)的異常是引發(fā)結(jié)腸癌的重要因素之一[11]。UA可以有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，但這一作用是否與TGF-β3或Wnt/β-catenin信號(hào)有關(guān)，尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)UA抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用進(jìn)行了相關(guān)研究，并分析介導(dǎo)UA這種作用的可能分子生物學(xué)機(jī)制。結(jié)果顯示，UA明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)凋亡，這種作用可能與UA通過(guò)下調(diào)TGF-β3表達(dá)，進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 試劑與細(xì)胞培養(yǎng) 熊果酸購(gòu)自西安昊軒生物科技有限公司。HCT116細(xì)胞購(gòu)自ATCC。本實(shí)驗(yàn)所用TGF-β3、Smad2/3、p-Smad2/3、Bcl-2、Bad和GAPDH等一抗均購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司。TGF-β3特異性抑制劑(2-methoxyestradiol)購(gòu)自賽力克公司。細(xì)胞培養(yǎng)采用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清、100 kU·L-1青霉素以及0.1 g·L-1鏈霉素)，細(xì)胞培養(yǎng)條件為5%的CO2和37 ℃。

1.2 重組腺病毒載體構(gòu)建 本實(shí)驗(yàn)使用的重組腺病毒載體通過(guò)AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建[12]。方法簡(jiǎn)述如下：以EST克隆為模板，用高保真Taq酶通過(guò)PCR將目的基因編碼序列擴(kuò)增并克隆到穿梭質(zhì)粒中。線(xiàn)性化穿梭質(zhì)粒后與骨架質(zhì)粒進(jìn)行同源重組，將重組正確的質(zhì)粒線(xiàn)性化后轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝，得到目的基因的重組腺病毒載體(以綠色熒光蛋白進(jìn)行標(biāo)記)。所建病毒載體包括綠色熒光蛋白重組腺病毒載體(AdGFP，作為對(duì)照)和TGF-β3重組腺病毒載體(Ad TGF-β3)。

1.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HCT116細(xì)胞均勻種到24孔板中，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入相應(yīng)濃度的UA處理細(xì)胞(對(duì)照組細(xì)胞用相同體積的DMSO處理)。于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行結(jié)晶紫染色[11]，檢測(cè)UA對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響情況。棄培養(yǎng)基，用PBS小心清洗孔板。每孔加入500 μL結(jié)晶紫飽和溶液(用PBS緩沖的10%甲醛配制)，室溫下孵育20 min, 然后棄染液并用自來(lái)水小心清洗孔板。將孔板在室溫下晾干并掃描，再用20%的乙酸溶解結(jié)晶紫，于590 nm測(cè)定吸光度。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞周期及凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 將HCT116細(xì)胞均勻種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。貼壁后，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入相應(yīng)濃度的UA進(jìn)行處理。48 h后收集細(xì)胞，并用PBS(4 ℃)清洗，按試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作。最后通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。采用Annexin V-EGFP和PI雙染法處理細(xì)胞，然后通過(guò)流式細(xì)胞儀分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 RNA提取及RT-PCR實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞種到T25培養(yǎng)瓶中，并用相應(yīng)濃度的UA進(jìn)行處理。采用TRIzol法提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備成cDNA。最后，通過(guò)PCR檢測(cè)目的基因mRNA的表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)所用引物序列如下：GAPDH上游引物5′-CAACGAATTTGGCTACAGCA-3′, 下游引物5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3′；TGF-β3上游引物5′-TGGTTAGAGGAAGGCTGAACTC-3′, 下游引物5′-ATGAGCAAATCCAACCTCAGAT-3′。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞均勻種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入相應(yīng)濃度的UA進(jìn)行處理。于處理后相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)提取各組總蛋白，通過(guò)BCA法測(cè)定總蛋白濃度。SDS-PAGE法進(jìn)行Western blot操作，利用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影并采集圖像。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒檢測(cè) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HCT116細(xì)胞種于T25培養(yǎng)瓶中，貼壁后Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染LEF/TCF4報(bào)告質(zhì)粒(pTOP-Luc)3μg，4 h后換液。24 h后將細(xì)胞收集，并重新種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別用不同濃度的UA處理。24 h后，棄培養(yǎng)基并裂解細(xì)胞，按試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定螢光素酶活性。用BCA法測(cè)定裂解液總蛋白濃度，用于標(biāo)準(zhǔn)化螢光素酶活性。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 UA對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響 結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，UA能有效地抑制HCT116細(xì)胞增殖，且抑制作用呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性增強(qiáng)(Fig 1A)；定量分析結(jié)果顯示，UA在15 μmol·L-1時(shí)已能明顯抑制細(xì)胞增殖(Fig 1B)。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，UA能明顯誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞發(fā)生G1期阻(Fig 1C)。結(jié)果提示，UA對(duì)HCT116細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用。

2.2 UA對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響 本研究進(jìn)一步分析UA能否誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。Western blot分析結(jié)果顯示，UA明顯增加Bad的水平，同時(shí)降低Bcl-2的水平(Fig 2A)。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，UA明顯呈濃度依賴(lài)性增加HCT116細(xì)胞凋亡比例(Fig 2B)。以上結(jié)果提示，UA對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用。

2.3 UA對(duì)HCT116細(xì)胞中TGF-β3表達(dá)水平的影響 TGF-β信號(hào)對(duì)細(xì)胞的增殖與分化有重要調(diào)節(jié)作用，該信號(hào)異常與結(jié)腸癌的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)。因此，我們接著分析UA對(duì)HCT116細(xì)胞的抗增殖作用是否與TGF-β有關(guān)。PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，UA呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性降低TGF-β3 的mRNA和蛋白水平；同時(shí)，UA也明顯降低Smad2/3的磷酸化水平，但對(duì)Smad2/3的總蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯影響(Fig 3)。結(jié)果提示，UA對(duì)HCT116細(xì)胞的抗增殖作用可能與抑制TGF-β3有關(guān)。

2.4 TGF-β3對(duì)UA抑制HCT116 細(xì)胞增殖作用的影響 為明確UA對(duì)HCT116細(xì)胞的抗增殖作用是否與其下調(diào)TGF-β3有關(guān)，本研究利用重組腺病毒介導(dǎo)的TGF-β3過(guò)表達(dá)或TGF-β3特異性抑制劑進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，外源性過(guò)表達(dá)TGF-β3部分逆轉(zhuǎn)UA誘導(dǎo)的G1期阻滯，但TGF-β3抑制劑則增強(qiáng)UA誘導(dǎo)G1期阻滯的作用(Fig 4A)。結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，外源性過(guò)表達(dá)TGF-β3能部分逆轉(zhuǎn)UA的抗增殖作用(Fig 4B)，TGF-β3特異性抑制劑則增強(qiáng)UA對(duì)HCT116細(xì)胞的增殖抑制作用(Fig 4C)。結(jié)果提示，下調(diào)TGF-β3表達(dá)能部分介導(dǎo)UA對(duì)HCT116細(xì)胞的增殖抑制作用，但具體機(jī)制尚不清楚。

2.5 TGF-β3與UA對(duì)HCT116細(xì)胞Wnt/β-cate-nin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響 Wnt/β-catenin 信號(hào)參與細(xì)胞增殖與分化的調(diào)節(jié)，該信號(hào)異常也是結(jié)腸癌發(fā)生的主要原因之一。因此，我們進(jìn)一步分析在HCT116細(xì)胞中UA是否會(huì)影響Wnt/β-catenin信號(hào)。螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒和Western blot結(jié)果顯示，UA呈濃度依賴(lài)性抑制LEF/Tcf4報(bào)告質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性(Fig 5A)，并明顯降低HCT116細(xì)胞中β-catenin的蛋白水平(Fig 5B)。UA對(duì)GSK3β的總蛋白無(wú)明顯影響，但能降低GSK3β的磷酸化水平(Fig 5B)。這些結(jié)果提示，UA的抗增殖作用可能與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。我們推測(cè)，TGF-β3表達(dá)的下調(diào)可能與Wnt/β-catenin信號(hào)被抑制有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HCT116細(xì)胞中，TGF-β3特異性抑制劑降低β-catenin蛋白表達(dá)，并增強(qiáng)UA對(duì)β-catenin表達(dá)的抑制作用(Fig 5C)；外源性過(guò)表達(dá)TGF-β3促進(jìn)β-catenin蛋白表達(dá)，并部分逆轉(zhuǎn)UA對(duì)β-catenin表達(dá)的抑制作用(Fig 5D)。以上結(jié)果提示，在人結(jié)腸癌細(xì)胞中，UA能通過(guò)下調(diào)TGF-β3實(shí)現(xiàn)對(duì)Wnt/β-catenin 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制作用。

Fig 1 Effects of UA on proliferation in HCT116 cells

A:The crystal violet staining showed the effect of UA on proliferation in HCT116 cells;B:The quantification results of crystal violet staining showed the effect of UA on proliferation in HCT116 cells.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;C:Flow cytometry analysis results showed the effect of UA on cell cycle in HCT116 cells

Fig 2 Effects of UA on apoptosis in HCT116 cells

A:Western blot results showed the effect of UA on the level of Bad and Bcl-2 in HCT116 cells;B:Flow cytometry analysis results showed the effect of UA on cell cycle in HCT116 cells

Fig 3 Effect of UA on TGF-β3 and Samd2/3 in HCT116 cells

A:PCR analysis results showed the effect of UA on the level of TGF-β3 in HCT116 cells;B:Western blot analysis results showed the effect of UA on the levels of TGF-β3, Smad2/3 and phosphorylation of Smad2/3 in HCT116 cells

3 討論

從傳統(tǒng)中草藥提取的天然產(chǎn)物或其衍生物是腫瘤化療藥物的重要來(lái)源之一，如長(zhǎng)春新堿、喜樹(shù)堿和紫杉醇等早已用于臨床。UA作為一種五環(huán)三萜類(lèi)化合物，普遍存在于多種藥用植物與水果中，且具有多種藥理活性，如鎮(zhèn)靜、降糖、抗炎和抗菌等。近年研究證實(shí)，UA還具有明顯的抗腫瘤活性[3,13]。其抗瘤機(jī)制可能與抑制STAT3、NF-κB、Wnt/β-catenin等有關(guān)[4,14-15]，但具體機(jī)制仍不清楚。本研究證實(shí)，UA能明顯抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖，機(jī)制分析表明，UA的這種作用可能與通過(guò)下調(diào)TGF-β3表達(dá)，進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

TGF-β是一類(lèi)分泌型蛋白，通過(guò)激活經(jīng)典Smads途徑，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化或凋亡等生理過(guò)程。TGF-β首先與其Ⅱ型受體結(jié)合，募集并使Ⅰ型受體磷酸化，活化后的Ⅰ型受體再募集并磷酸化Smad2與Smad3。磷酸化的Smad2/3使Smad4磷酸化，并與之結(jié)合形成異二聚體，然后轉(zhuǎn)位入核，與相應(yīng)的效應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)節(jié)下游靶基因表達(dá)。研究報(bào)道，TGF-β信號(hào)通路的異常是結(jié)腸癌的主要病因之一，其3種亞型均與結(jié)腸癌相關(guān)[16]。 由于TGF-β3在腫瘤組織中的表達(dá)水平明顯要高于正常腸黏膜組織[9]，因此我們推測(cè)TGF-β3在結(jié)腸癌的發(fā)展中可能起著關(guān)鍵作用。我們的研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，UA對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞具有抗增殖作用，但這種效應(yīng)是否與TGF-β3有關(guān)仍不清楚。通過(guò)進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示UA明顯抑制TGF-β3表達(dá)，并明顯降低Smad2/3的磷酸化水平；外源性過(guò)表達(dá)TGF-β3則能部分逆轉(zhuǎn)UA對(duì)HCT116細(xì)胞的增殖抑制作用，而抑制TGF-β3則相應(yīng)增強(qiáng)UA對(duì)HCT116細(xì)胞的抗增殖作用。以上結(jié)果提示，UA對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的抑制作用可能與其下調(diào)TGF-β3表達(dá)有關(guān)，但TGF-β3介導(dǎo)UA這種作用的機(jī)制尚不清楚。

Fig 4 Effect of TGF-β3 on anti-proliferation effect of UA in HCT116 cells

A:Flow cytometry analysis results showed the effect of TGF-β3 on the cell cycle arrest effect of UA in HCT116 cells;B:The crystal violet staining results showed the effect of TGF-β3 on the anti-proliferation effect of UA in HCT116 cells;C:The crystal violet staining results showed the effect of TGF-β3 specific inhibitor on the anti-proliferation effect of UA in HCT116 cells(2-MeOE2:TGF-β3 inhibitor)

Fig 5 Effect of TGF-β3 on Wnt/β-catenin signaling in HCT116 cells

A:Luciferase reporter assay results showed the effect of UA on Wnt/β-catenin in HCT116 cells;B:Western blot analysis results showed the effect of UA on GSK-3β and the phosphorylation of GSK-3β in HCT116 cells;C:Western blot analysis results showed the effect of TGF-β3 specific inhibitor on the UA-induced decrease of β-catenin in HCT116 cells(2-MeOE2:TGF-β3 inhibitor);D:Western blot analysis results showed the effect of TGF-β3 on the UA-induced decrease of β-catenin in HCT116 cells

Wnt/β-catenin信號(hào)的異常是結(jié)腸癌的重要發(fā)病原因之一。這種異?？赡芘c其重要成員突變有關(guān)，如APC和β-catenin等[11]。除此之外，Wnt/β-catenin信號(hào)本身也受其他信號(hào)的調(diào)節(jié)，如IGFs、PI3K/Akt、p53、TGF-β等。其中，TGF-β3受到Wnt/β-catenin 信號(hào)的調(diào)節(jié)[17]，即TGF-β3與Wnt/β-catenin 信號(hào)之間可能存在相互調(diào)節(jié)的關(guān)系，但在結(jié)腸癌細(xì)胞中，TGF-β3與Wnt/β-catenin 信號(hào)之間的關(guān)系仍不清楚。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HCT116細(xì)胞中，UA明顯抑制Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并明顯降低β-catenin的蛋白表達(dá)水平；外源性過(guò)表達(dá)TGF-β3部分逆轉(zhuǎn)UA對(duì)β-catenin 表達(dá)的抑制作用；抑制TGF-β3則能促進(jìn)UA對(duì)β-catenin表達(dá)的抑制作用。

本研究表明，UA對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞具有增殖抑制作用，這種作用可能與其通過(guò)下調(diào)TGF-β3表達(dá)水平，進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。但在結(jié)腸癌細(xì)胞中， UA抑制TGF-β3表達(dá)，以及TGF-β3調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的具體過(guò)程還有待進(jìn)一步深入研究。

[致謝：本實(shí)驗(yàn)在重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。感謝何通川教授(Tong-Chuan He, 芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心)為本研究提供重組腺病毒。]

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Relationship between TGF-β3 and anti-proliferative effect of ursolic acid in human colon cancer cells

SHAO Ying1,2,WANG Dong-xu1,2,CHEN Qian-zhao1,2, ZENG Yu-hua1,2,ZHOU Lin-yun1,2,ZHOU Yi1,2,REN Wen-yan1,2,HE Bai-cheng1,2

(1.DeptofPharmacology, 2.ChongqingKeyLaboratoryofBiochemistryandMolecularPharmacology,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Aim To investigate the role of TGF-β3 in the anti-proliferation effect of ursolic acid(UA) in colon cancer cells and the possible molecular mechanism underlying this effect.Methods We introduced crystal violet staining, flow cytometry and Western blot assay to determine the effect of UA on proliferation and apoptosis in HCT116 cells. The levels of TGF-β3, Smad2/3 and β-catenin in HCT116 cell were evaluated by RT-PCR and Western blot. Finally, TGF-β3 inhibitor and recombinant adenovirus, and luciferase reporter assay were used to analyze the possible mechanism through which TGF-β3 mediated the anti-cancer effect of UA in HCT116 cells.Results UA inhibited the proliferation and induced apoptosis apparently in HCT116 cells. UA down-regulated TGF-β3 both in mRNA and in protein level. Meanwhile, UA decreasedthe phosphorylation of Smad2/3 concentration dependently, although no significant effect was found on the total protein level of Smad2/3 in HCT116 cells. Over-expression of TGF-β3 attenuated the inhibitory effect of UA on the proliferation of HCT116 cells，while the TGF-β3 inhibitor potentiated this effect. UA suppressed the transconduction of Wnt/β-catenin signaling in HCT116 cells through decreasing the level of β-catenin. Exogenous expression of TGF-β3 increased the level of β-catenin and partly reversed the UA-induced decrease of β-catenin. However, TGF-β3 inhibitor potentiated the inhibitory effect of UA on β-catenin in HCT116 cells.Conclusion The anti-proliferation activity of UA in colon cancer may be partly mediated through down-regulating TGF-β3 to suppress Wnt/β-catenin signaling at least.

ursolic acid; colon cancer; anti-proliferation; apoptosis;TGF-β3; Wnt/β-catenin

時(shí)間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.020.html

2016-10-27,

2016-11-25

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81572226)

邵 英(1990-)，女，碩士生，研究方向：分子藥理學(xué)，E-mail:18180058158@163.com； 何百成(1972-)，男，博士，教授，研究方向：分子藥理學(xué)和干細(xì)胞生物學(xué)，通訊作者，E-mail：hebaicheng99@yahoo.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.010

A

1001-1978(2017)02-0191-07

R284.1；R329.24；R329.25；R735.35；R977.6