賈淑偉+王玲+焦?jié)櫳?/p>

[摘要] 目的 探討延髓頭端腹外側(cè)部在腦梗死合并心律失常中的作用及可能機(jī)制。 方法 112只Wistar大鼠隨機(jī)分為3組：對照組（n=16）、假手術(shù)組（n=16）和模型組（n=80）。模型組再隨機(jī)分為造模后30 min、1 h、2 h、4 h 和8 h組，每組16只，觀察腦梗死后延髓頭端腹外側(cè)部神經(jīng)元活動的變化。另40只大鼠隨機(jī)分為5組：對照組（n=8）、生理鹽水組（10 μL，n=8）、L-谷氨酸組（0.5 μmol，10 μL，n=8）、谷氨酸非選擇性NMDA受體拮抗劑MK-801（4 nmol，10 μL）加L-谷氨酸組（n=8）和MK-801加模型組（n=8），以觀察谷氨酸在腦梗死誘發(fā)心律失常中的作用。心電圖用生物信號采集系統(tǒng)采集。腦梗死動物模型制作采用大鼠大腦中動脈栓塞（MCAO），給藥途徑為側(cè)腦室注射，以Fos蛋白作為神經(jīng)元激活的標(biāo)志物。 結(jié)果 對照組和假手術(shù)組大鼠心電圖均無明顯異常，模型組大鼠心律失常的發(fā)生率為78.75%（63/80），明顯高于對照組（P < 0.01），且在心律失常發(fā)生的相應(yīng)時間點(diǎn)延髓頭端腹外側(cè)部Fos蛋白表達(dá)明顯增加（P < 0.01）。側(cè)腦室注射生理鹽水組心電圖無明顯異常，側(cè)腦室注射L-谷氨酸后心律失常發(fā)生率為87.5%（7/8），明顯高于生理鹽水組（P < 0.01），心律失常類型類似于模型組，同時延髓頭端腹外側(cè)部Fos蛋白表達(dá)明顯增高（P < 0.05）。MK-801預(yù)處理后再造模和MK-801預(yù)處理后再側(cè)腦室注射L-谷氨酸組，均無心律失常發(fā)生，延髓頭端腹外側(cè)部Fos蛋白表達(dá)無顯著性變化（P > 0.05）。 結(jié)論 腦梗死合并心律失常的發(fā)生與延髓頭端腹外側(cè)部活動增強(qiáng)有關(guān)，且此作用由谷氨酸激活NMDA受體介導(dǎo)。

[關(guān)鍵詞] 延髓頭端腹外側(cè)部；腦梗死；心律失常；谷氨酸；NMDA受體

[中圖分類號] R338 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）11（a）-0011-05

腦梗死合并心律失常是腦梗死猝死的主要原因之一[1]。大量研究表明，腦自主神經(jīng)功能失衡，特別是交感神經(jīng)過度激活可致心律失常的發(fā)生[2]。合并心律失常的腦梗死患者存在著交感和副交感神經(jīng)活動失衡[3-4]，但特異性的心電圖異常與局部顱內(nèi)病變之間的對應(yīng)關(guān)系尚未建立。延髓頭端腹外側(cè)部（rostral ventrolateral medulla，RVLM）是腦內(nèi)控制自主神經(jīng)功能和心血管活動的關(guān)鍵腦區(qū)，本研究觀察了RVLM活動變化在腦梗死合并心律失常中的作用及可能機(jī)制，以期為臨床治療提供理論依據(jù)，并豐富心血管功能活動調(diào)節(jié)的中樞機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性Wistar大鼠，體重（230±20）g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（黑）2013-001，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（黑）2013-002。

1.2 藥物與試劑

c-Fos多克隆抗體（sc-52，Santa Cruz）、AP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（zb-2308）和AP標(biāo)記的馬抗小鼠二抗（zd-2310）均購自中杉金橋公司。GAPDH單克隆抗體（小鼠）購自碧云天生物技術(shù)研究所。TTC購自中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司。

1.3 儀器

大鼠腦立體定位儀SN-3，日本Narishige；顯微圖像采集系統(tǒng)，日本Olympus；石蠟切片機(jī)RM2016，德國徠卡；凝膠成像系統(tǒng)，美國Alpha；RM6240B生物信號采集系統(tǒng)，中國成都泰盟。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

所有大鼠監(jiān)測心電20 min，心電圖正常者用于實(shí)驗(yàn)。為了觀察腦梗死后RVLM神經(jīng)元活動的變化，112只大鼠隨機(jī)分為3組：對照組（n=16）、假手術(shù)組（n=16）和模型組（n=80）。模型組再隨機(jī)分為造模后30 min、1 h、2 h、4 h和8 h組，每組16只。對照組和假手術(shù)組大鼠在麻醉后或假手術(shù)操作后2 h取材，模型組大鼠在造模后相應(yīng)的時間點(diǎn)取材。用免疫組織化學(xué)技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測每只大鼠右側(cè)腦（缺血側(cè)）RVLM腦區(qū)Fos蛋白的表達(dá)。為了觀察谷氨酸在腦梗死誘發(fā)心律失常中的作用，40只大鼠隨機(jī)分為5組，每組8只：對照組、生理鹽水組（10 μL）、L-谷氨酸組（0.5 μmol，10 μL）、MK-801（4 nmol，10 μL）后20 min再L-谷氨酸組和MK-801（4 nmol，10 μL）后20 min再造模組。所有大鼠在側(cè)腦室注射后或術(shù)后30 min取材。用Western blot技術(shù)檢測每只大鼠右側(cè)腦RVLM腦區(qū)Fos蛋白表達(dá)。

1.5 腦缺血動物模型制備

水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉。栓線經(jīng)頸總動脈、頸內(nèi)動脈插入大腦中動脈，進(jìn)線長度距頸總動脈分叉（17.5 ± 0.5）mm[5]。假手術(shù)組栓線到大腦中動脈起始處后立即撤回，其余操作與模型組相同。

1.6 模型鑒定

神經(jīng)功能學(xué)評分大于2分且TTC染色梗死區(qū)明顯者計(jì)入模型組。

1.6.1 神經(jīng)功能學(xué)評分 神經(jīng)功能學(xué)評分值為0～4分，其中，沒有神經(jīng)功能缺陷計(jì)0分；前肢屈曲計(jì)1分；對側(cè)前肢輕度抓爪計(jì)2分；讓大鼠自由活動，拉其尾巴后大鼠向輕癱側(cè)繞圈行走計(jì)3分；如果大鼠未受任何刺激自發(fā)向輕癱側(cè)繞圈行走計(jì)4分[6-8]。

1.6.2 TTC染色 將大鼠腦做2 mm厚的連續(xù)冠狀切片，置于2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）生理鹽水溶液中，37℃孵育15 min。紅色染色區(qū)為正常腦組織，白色未染色區(qū)為梗死區(qū)。

1.7 免疫組化檢測

大鼠灌注固定后將含RVLM的腦組織塊石蠟包埋，冠狀切片（5 μm），水化，修復(fù)抗原，10% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物后5% BSA封閉，兔來源的Fos抗體（1∶200）4℃孵育過夜，PBS洗3次，二抗（1∶500）37℃孵育30 min，DAB避光染色5 min，水沖，蘇木精染色30 s，水沖，再次脫水、透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。Fos表達(dá)陽性神經(jīng)元的核呈黃棕色染色，在高倍鏡（400×）下分別計(jì)數(shù)5個區(qū)域陽性神經(jīng)元數(shù)，然后取平均值。

1.8 Western blot檢測

腦組織加入組織裂解液（RIPA∶PMSF為100∶1）研磨，4℃ 1000 r/min離心15 min得到勻漿液，取上清，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，上樣，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，3%牛血清白蛋白37℃封閉1 h，TBST洗膜，孵一抗（1∶500）4℃過夜，TBST洗膜，孵二抗（1∶1000）37℃ 1 h，TBST洗膜，BCIP/NBT顯色。內(nèi)參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）。結(jié)果用Alphaview 3.1.1.0軟件分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MCAO大鼠心電圖變化

對照組和假手術(shù)組大鼠無心律失常發(fā)生，模型組大鼠心律失常的發(fā)生率高達(dá)78.75%（63/80），明顯高于對照組（P < 0.01），與臨床報道一致[1]，但心律失常的發(fā)生率偏高，可能與實(shí)驗(yàn)動物模型腦缺血程度相對均一，而腦梗死患者的損傷程度不可能均一有關(guān)。MCAO后大鼠會出現(xiàn)2次心律失常，分別在MCAO后（15.63±1.58）min，持續(xù)（31.02±1.85）min；（238.36±14.32）min，持續(xù)（26.28±1.36）min。心律失常類型主要是室性期前收縮（室性二聯(lián)律）和室性快速性心律失常。側(cè)腦室注射生理鹽水組心電圖無明顯異常，側(cè)腦室注射L-谷氨酸后心律失常發(fā)生率為87.5%（7/8），明顯高于生理鹽水組（P < 0.01），心律失常類型類似于模型組大鼠。側(cè)腦室注射谷氨酸非選擇性NMDA受體拮抗劑MK-801后的20 min內(nèi)未見心律失常的發(fā)生，20 min后行MCAO和20 min后側(cè)腦室注射L-谷氨酸都未見心律失常的發(fā)生，提示腦梗死能誘發(fā)心律失常，且與谷氨酸作用于NMDA受體的有關(guān)。

2.2 MCAO后RVLM內(nèi)Fos蛋白表達(dá)免疫組化結(jié)果

筆者先期進(jìn)行室旁核[8]研究時，分別觀察了MCAO后15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h和16 h室旁核活動的改變與心律失常發(fā)生的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)對照組和假手術(shù)組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；室旁核的活動從15 min開始增強(qiáng)，持續(xù)到30 min時達(dá)峰值，認(rèn)為30 min的增強(qiáng)是15 min的延續(xù)；16 h后室旁核的活動改變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。故本研究只觀察了MCAO后30 min、1 h、2 h、4 h和8 h RVLM活動的改變，發(fā)現(xiàn)在對照組，RVLM內(nèi)只可見極少量淡染的陽性神經(jīng)元；在模型組，RVLM內(nèi)陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增加且染色加深，與對照組比較，MCAO后30 min和4 h RVLM內(nèi)神經(jīng)元Fos陽性表達(dá)的增加，且差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見圖2（封四）。

2.3 MCAO后RVLM內(nèi)Fos蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果

與對照組比較，MCAO后RVLM神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)在30 min和4 h明顯增加（P < 0.01）（圖3），與免疫組化結(jié)果一致，表明MCAO后RVLM神經(jīng)元被激活了兩次，分別在30 min和4 h左右，與MCAO后心律失常發(fā)生時間點(diǎn)相對應(yīng)，說明MCAO后心律失常的發(fā)生與RVLM激活有關(guān)。

2.4 RVLM內(nèi)Fos蛋白表達(dá)的谷氨酸能機(jī)制

與對照組比較，側(cè)腦室注射生理鹽水后RVLM內(nèi)Fos蛋白表達(dá)無明顯變化（P > 0.05），側(cè)腦室注射L-谷氨酸后RVLM內(nèi)Fos蛋白的表達(dá)明顯增加（P < 0.05），側(cè)腦室注射MK-801可阻斷側(cè)腦室注射L-谷氨酸（P > 0.05）和MCAO（P > 0.05）引起的Fos蛋白表達(dá)的增加（圖4）。提示腦梗死后RVLM的激活由腦內(nèi)高水平的谷氨酸作用于NMDA受體所介導(dǎo)。

A：對照、側(cè)腦室注射生理鹽水（10 μL）、側(cè)腦室注射L-谷氨酸（0.5 μmol，10 μL）以及MK-801（4 nmol，10 μL）預(yù)處理后給予谷氨酸和MCAO后RVLM內(nèi)Fos蛋白表達(dá)的Western blot條帶；B：上述不同條件下RVLM內(nèi)Fos蛋白表達(dá)變化的統(tǒng)計(jì)圖，與對照組比較，*P < 0.05

和MCAO后RVLM內(nèi)Fos蛋白表達(dá)的Western blot結(jié)果

3 討論

腦梗死早期合并心律失?；颊撸鸩〖保兓?，不能用腦疝來解釋[9]，許多合并心律失常的腦梗死患者并無原發(fā)心臟病史[10]，提示腦梗死合并心律失常的發(fā)生源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。腦自主神經(jīng)功能失衡，特別是交感神經(jīng)過度激活可誘導(dǎo)致命性心律失常的發(fā)生[2]，而且合并心律失常的腦梗死患者確實(shí)存在交感和副交感神經(jīng)活動失衡[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，電或化學(xué)刺激RVLM，可使交感神經(jīng)興奮性增加，心率加快，血壓上升和誘發(fā)心電異常，而損毀兩側(cè)RVLM，可使交感神經(jīng)興奮性降低和交感節(jié)律消失，血壓降到神經(jīng)節(jié)阻斷和脊椎動物水平[11-12]，可見RVLM是脊髓以上中樞調(diào)控交感神經(jīng)輸出的重要通路，是中樞調(diào)控心血管活動的重要腦區(qū)之一，且可因其活動增強(qiáng)使交感神經(jīng)過度激活而誘發(fā)心電異常。本研究發(fā)現(xiàn)MCAO后，78.75%出現(xiàn)心律失常的大鼠RVLM活動增強(qiáng)，提示腦梗死后心律失常的發(fā)生與RVLM活動增強(qiáng)導(dǎo)致的交感神神經(jīng)過度興奮有關(guān)。

RVLM內(nèi)可見谷氨酸免疫陽性結(jié)構(gòu)[13-15]，刺激RVLM組織切片上的多數(shù)交感節(jié)前神經(jīng)元所產(chǎn)生的快興奮性突觸后電位可被谷氨酸受體阻斷藥消除[16]，RVLM內(nèi)微量注射谷氨酸能引起血壓升高和心率加快，刺激丘腦下部所引起的心血管效應(yīng)，能被RVLM內(nèi)注射谷氨酸受體阻斷藥阻斷[17]。形態(tài)學(xué)證實(shí)，RVLM內(nèi)既存在內(nèi)源性谷氨酸能神經(jīng)元，也存在外源性的谷氨酸能神經(jīng)傳入。前者可投射到脊髓中間外側(cè)柱的交感節(jié)前神經(jīng)元，興奮交感神經(jīng)[18]，是延髓到交感節(jié)前神經(jīng)元的所有興奮性傳出的關(guān)鍵部位；后者可能來自孤束核、室旁核（paraventricular nucleus，PVN）等中樞核團(tuán)的纖維投射，這些投射到RVLM的谷氨酸能神經(jīng)元可通過NMDA受體介導(dǎo)交感緊張性興奮[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)腦室注射L-谷氨酸后，RVLM被激活，此激活可被NMDA受體拮抗劑MK-801阻斷，且MK-801也能阻斷MCAO后RVLM的激活。這些結(jié)果提示腦梗死后腦內(nèi)異常增高的谷氨酸可能通過作用于NMDA受體使RVLM激活，進(jìn)而激活脊髓中間外側(cè)柱交感節(jié)前神經(jīng)元，使交感神經(jīng)輸出增加，誘發(fā)心律失常。解剖學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，貓的PVN存在向RVLM的纖維投射，電刺激PVN細(xì)胞可順行激活RVLM，損毀雙側(cè)RVLM幾乎去除電刺激PVN引起的增壓反應(yīng)，表明RVLM介導(dǎo)PVN的增壓反應(yīng)，RVLM神經(jīng)元是PVN下行交感興奮通路的一部分，構(gòu)成的PVN-RVLM-脊髓通路在交感神經(jīng)系統(tǒng)和心血管活動的調(diào)節(jié)中起著重要作用[14-15]。Yang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，刺激PVN可使心率增加、腎交感神經(jīng)興奮，RVLM內(nèi)注射谷氨酸也能使心率增加、腎交感神經(jīng)興奮，若是在刺激PVN的同時給予谷氨酸受體拮抗劑犬尿烯酸，上述現(xiàn)象不再出現(xiàn)。說明從PVN到RVLM的突觸中谷氨酸是作為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)而起作用。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，MCAO后PVN活動增高[8]，提示腦梗死后RVLM活動的增強(qiáng)也可能是腦內(nèi)高濃度的谷氨酸使PVN活動增強(qiáng)的結(jié)果，進(jìn)而使交感神經(jīng)的輸出增加，誘發(fā)心律失常。

總之，腦梗死合并心律失常的發(fā)生與腦梗死后RVLM活動增強(qiáng)有關(guān)，且此作用由谷氨酸激活NMDA受體所介導(dǎo)。

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（收稿日期：2016-06-13 本文編輯：程 銘）