茹曉婷+劉勤江+楊榮

[摘要] 目的 探討過氧化物酶增殖物激活受體γ（PPAR-γ）在分化型甲狀腺癌（DTC）中的表達情況與臨床病理特征及分子特征（BRAFV600E）之間的關(guān)系。 方法 收集甘肅省腫瘤醫(yī)院頭頸外科2014年10月～2016年1月臨床病理確診的分化型甲狀腺癌219例[206例乳頭狀甲狀腺癌（PTC）、13例濾泡狀甲狀腺癌（FTC）]、52例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及癌旁正常甲狀腺組織31例；通過免疫組織化學(xué)染色檢測PPAR-γ表達。 結(jié)果 PTC、FTC、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及癌旁正常甲狀腺組織PPAR-γ陽性表達率分別為48.5%（100/206）、53.9%（7/13）、46.2%（24/52）和64.5%（20/31），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.172，P = 0.366）；PPAR-γ表達與分化型甲狀腺癌性別（P = 0.266）、年齡（P = 0.187）、腫塊大小（P = 0.323）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P = 0.558）、TNM分期（P = 0.146）及復(fù)發(fā)危險度分層（P = 0.974）均無相關(guān)性；BRAFV600E突變組和BRAFV600E野生組中PPAR-γ表達陽性率分別為54.1%（85/157）和35.5%（22/62），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.191，P = 0.013）。 結(jié)論 未發(fā)現(xiàn)PPAR-γ表達和臨床病理特征之間的關(guān)系，還需進一步研究；PPAR-γ可能與BRAFV600E突變共同參與DTC的發(fā)生和發(fā)展，提示PPAR-γ有望作為治療分化型甲狀腺癌的靶點。

[關(guān)鍵詞] 分化型甲狀腺癌；過氧化物酶增殖物激活受體γ；BRAFV600E突變

[中圖分類號] R736.1 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）11（a）-0025-04

過氧化物酶增殖物激活受體γ（PPAR-γ）是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，PPAR根據(jù)結(jié)構(gòu)不同分為α、β和γ三種類，其中PPAR-γ分布最為廣泛。PPAR-γ編碼一種細胞核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子亞型的過氧化酶增殖物激活受體，具有調(diào)節(jié)脂肪細胞分化、脂肪及碳水化合物的代謝、抑制炎性反應(yīng)、細胞增殖與分化、細胞周期調(diào)控及腫瘤形成等多種功能[1]。研究證實，PPAR-γ在肺癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中均有表達[2-6]，并且在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療中發(fā)揮著重要作用。但國內(nèi)關(guān)于PPAR-γ在甲狀腺癌中的報道相對較少。因此，本研究采用免疫組化檢測PPAR-γ在分化型甲狀腺癌（DTC）中的表達情況，并分析PPAR-γ與分化型甲狀腺癌中臨床病理特征及分子特征之間的關(guān)系，為DTC的診斷及治療提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集甘肅省腫瘤醫(yī)院頭頸外科2014年10月～2016年1月臨床病理確診的分化型甲狀腺癌219例，包括206例乳頭狀甲狀腺癌（PTC）、13例濾泡狀甲狀腺癌（FTC）[男62例，女157例；年齡14～81歲，平均（45.6±12.9）歲]。按照美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）第7版DTC的TNM分期系統(tǒng)，Ⅰ期107例，Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期84例；并取正常甲狀腺組織31例作為對照。所有患者均按照統(tǒng)一方案進行診斷和治療[7]。根據(jù)《甲狀腺結(jié)節(jié)和分化型甲狀腺癌診治指南》[8]提出的復(fù)發(fā)危險度分層將所有標(biāo)本劃分為低危組和中、高危組，其中低危組98例，中、高危組121例。本次研究已獲醫(yī)院倫理委員會的審批和認可，且所有標(biāo)本均獲患者及家屬知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑 一抗PPAR-γ兔抗人多克隆抗體（1∶200）、SP-9000試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 PPAR-γ免疫組織化學(xué)染色 所有標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛固定，脫水后石蠟包埋，將石蠟包埋標(biāo)本行4 μm厚的連續(xù)切片，60℃烘烤過夜。嚴格按照SP法免疫組織化學(xué)染色操作說明進行：切片脫蠟至水；高壓修復(fù)抗原5 min；PBS沖洗3次，每次3 min，擦干；使用二抗同種動物血清15 min擦干后，直接滴加一抗（1∶200），放于37℃恒溫箱2 h；PBS沖洗3次，每次3 min，擦干；滴加生物素化二抗，室溫，15 min；PBS沖洗3次，每次3 min，擦干；滴加三抗辣根酶復(fù)合物15 min；PBS沖洗3次，每次3 min，擦干。DAB顯色5 min，顯微鏡下控制；水洗終止染色；酸分化水洗、堿返藍水洗、梯度乙醇脫水；中性樹膠封固，顯微鏡下觀察；PBS代替一抗作為空白對照。在進行免疫組化切片后，另切5～10 μm厚的蠟片放于EP管送基因突變檢測實驗室進行BRAFV600E突變檢測，根據(jù)檢測結(jié)果，將全部標(biāo)本分為BRAFV600E突變組和BRAFV600E野生組。

1.3 結(jié)果判定

PPAR-γ定位于細胞質(zhì)和/或細胞核。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷參照文獻[9]采用半定量分析法：依照細胞陽性著色程度（抗原含量）可分為：弱陽性（+）計1分；中等陽性（++）計2分；強陽性（+++）計3分，無著色直接計0分。依照陽性細胞數(shù)量可分為：弱陽性（+），陽性細胞數(shù)在25%以下計1分；中等陽性（++），陽性細胞數(shù)在25%～<50%計2分；強陽性（+++），陽性細胞數(shù)≥50%計3分；陽性細胞數(shù)在5%以下直接計0分。隨機選取5個視野，200倍光學(xué)顯微鏡計數(shù)100個細胞，陽性細胞數(shù)為這5個視野的平均數(shù)。將每張片子著色程度得分和著色細胞百分率得分相乘，最后得分0分為陰性，≥1分為陽性（1～2分為+；3～4分為++；≥5分為+++）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

本文所有數(shù)據(jù)均借助于SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準差（x±s）表示，率的比較采用交叉表格Pearsonchi-square（χ2）檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PPAR-γ在分化型甲狀腺癌組織以及正常甲狀腺組織中的表達

PPAR-γ免疫組化陽性產(chǎn)物主要定位于細胞漿和/或細胞核周（圖1，封四），PTC、FTC、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及正常甲狀腺組織PPAR-γ陽性率分別為48.5%、53.9%、46.2%和64.5%，PPAR-γ在甲狀腺惡性腫瘤、良性腫瘤及正常甲狀腺組織中均有表達，統(tǒng)計結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.172，P = 0.366>0.05）。見表1。

2.2 PPAR-γ表達與分化型甲狀腺癌臨床病理特征及分子特征之間的關(guān)系

統(tǒng)計結(jié)果顯示PPAR-γ表達與分化型甲狀腺癌性別（P = 0.266）、年齡（P = 0.187）、腫塊大?。≒ = 0.323）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P = 0.558）、TNM分期（P = 0.146）及復(fù)發(fā)危險度分層（P = 0.974）均無相關(guān)性。而BRAFV600E突變組PPAR-γ陽性率[54.1%（85/157）]高于BRAFV600E野生組[35.5%（22/62）]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.013<0.05）。

3 討論

近年來，甲狀腺癌的發(fā)病率日漸上升，而DTC占所有甲狀腺癌的90%以上。DTC治療以手術(shù)為主，包括131I和TSH抑制治療在內(nèi)的綜合治療，10年生存率達95%以上[10]，但DTC復(fù)發(fā)率高達30%[11]，將會影響其生存率。因此，尋找特異性的分子標(biāo)志對DTC的預(yù)后進行評估極其重要。

PPAR-γ基因位于染色體3p25，編碼一種細胞核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子亞型的PPAR-γ，屬于核內(nèi)受體超家族成員，PPAR-γ活化后通過與靶基因啟動子區(qū)的過氧化酶增殖物反應(yīng)原件（PPRE）相互作用進而調(diào)控相關(guān)基因的表達。在甲狀腺中，PPAR-γ在良性及不同病理分類的惡性腫瘤組織中均有不同程度的表達[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，PTC中PPAR-γ陽性率為48.5%，F(xiàn)TC中為53.9%，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫中為46.2%，正常甲狀腺組織中為64.5%，PPAR-γ在甲狀腺良性與惡性組織中均有表達且差異不大，與以前研究結(jié)果相似[14]。因此本研究結(jié)果提示PPAR-γ免疫組化染色并不能作為診斷甲狀腺腫瘤的特異性分子標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)PPAR-γ表達與DTC性別、年齡、腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及復(fù)發(fā)危險度分層也均無相關(guān)性。出現(xiàn)這種結(jié)果可能由于PPAR-γ在甲狀腺癌致癌機制中的作用極其復(fù)雜所造成的。一部分研究認為PPAR-γ可作為腫瘤抑制因子，PPAR-γ激動劑能阻滯細胞周期和誘導(dǎo)細胞凋亡，從而有效抑制癌細胞增殖[14]，Kato等[15]研究認為PTC中PPAR-γ表達不足，通過激活核內(nèi)NF-κB信號通路促進腫瘤形成。而另一部分研究認為PPAR-γ可作為腫瘤促進因子，Wood等[16]研究認為PPAR-γ被敲除后，降低了甲狀腺未分化癌的侵襲性；PPAR-γ在DTC細胞中高水平表達，并且缺乏任何配體，也促進癌細胞生長。Kroll等[17]報道，在FTC中，PPAR-γ與Pax8發(fā)生基因重排，表達一種包括PAX8前9個外顯子及全長PPAR-γ1在內(nèi)的融合蛋白PPFP。Giordano等[18]研究認為PPAR-γ與Pax8發(fā)生重排后產(chǎn)生的融合蛋白PPFP是一種轉(zhuǎn)錄因子，在相應(yīng)的基因啟動子和細胞環(huán)境下，使一些蛋白的基因表達增加，如通過上調(diào)表皮生長因子受體（EGFR）基因的表達，導(dǎo)致下游相關(guān)基如BRAF等的激活，致使下游信號通路被持續(xù)性激活，從而使細胞發(fā)生癌變，并且基因報告分析證明PPAR-γ與PPFP功能相似，說明PPAR-γ確實能促進細胞癌變。另外，部分研究認為PPAR-γ激動劑可以抑制癌細胞生長[14]，但這并不能確定PPAR-γ激動劑是受體依賴性的還是獨立性的，更不能說明是PPAR-γ自身產(chǎn)生了抑癌效應(yīng)。產(chǎn)生這種爭議也可能是由于許多體外的試驗研究并不能與體內(nèi)腫瘤所處的微環(huán)境完全一致所造成。然而，本研究在分析PPAR-γ在BRAFV600E突變組和未突變組中的表達情況時發(fā)現(xiàn)，BRAFV600E突變組PPAR-γ陽性率（54.1%）高于BRAFV600E未突變組（35.5%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。該結(jié)果似乎也支持PPAR-γ作為促癌因子的觀點。筆者推測可能是由于PPAR-γ活化后通過與過氧化酶增殖物反應(yīng)原件PPRE相互作用進而調(diào)控相關(guān)基因的表達，一些生長調(diào)控基因如RAS、C-myc等就含有PPRE原件[19]，而BRAF是RAS癌基因下游的效應(yīng)器，PPAR-γ過表達與RAS基因內(nèi)的PPRE原件相結(jié)合，引起RAS-RAF-MEK-ERK信號通路的紊亂，由于BRAFV600E的突變更是加劇了這一過程，導(dǎo)致癌的發(fā)生。因此，PPAR-γ在甲狀腺腫瘤中的作用是極其復(fù)雜的，再一個可能也與PPAR-γ/PAX-8重排相關(guān)，該重排不僅發(fā)生于FTC也發(fā)生于PTC及良性甲狀腺組織[20]，當(dāng)進行免疫組化染色時，陽性部位具體是PPAR-γ基因編碼的PPAR-γ蛋白還是由PPAR-γ/PAX-8重排后表達的融合蛋白的PPAR-γ所表達的部分，其中的機制并不十分明確，所以關(guān)于PPAR-γ在甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用以及是否可作為診斷或預(yù)后評估指標(biāo)還需進一步研究確認。

然而就本研究結(jié)果來看，本研究雖未發(fā)現(xiàn)PPAR-γ對DTC診斷和預(yù)后評估的價值，但發(fā)現(xiàn)在BRAFV600E突變組的DTC中，PPAR-γ陽性率是較高的，提示PPAR-γ可能參與調(diào)控RAS-RAF-MEK-ERK信號通路，與BRAFV600E突變共同作用促進腫瘤產(chǎn)生，PPAR-γ有望作為治療DTC的靶點。

[參考文獻]

[1] Willson T，Brown P，Sternbach DB. The PPARs：from orphan receptors to drug discovery [J]. J Med Chem，2000， 43（43）：527-550.

[2] Herrera CL，Kim DY，Kumar SR，et al. Peroxisome proliferator activated receptor γ protein expression is asymmetrically distributed in primary lung tumor and metastatic to lung osteosarcoma samples and does not correlate with gene methylation [J]. Bmc Veterinary Research，2015，11（1）：1-11.

[3] Guo F，Ren X，Dong Y，et al. Constitutive expression of PPAR-γ inhibits proliferation and migration of gastric cancer cells and down-regulates Wnt/β-Catenin signaling pathway downstream target genes TERT and ENAH [J]. Gene，2016，584（1）：31-37.

[4] Abduljabbar R，Alkaabi MM，Negm OH，et al. Prognostic and biological significance of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in luminal breast cancer [J]. Breast Cancer Research & Treatment，2015，150（3）：511-522.

[5] Kwon KA，Yun J，Oh SY，et al. Clinical significance of peroxisome proliferator-activated receptor γ and TRAP220 in patients with operable colorectal cancer [J]. Cancer Research & Treatment，2016，48（1）：198-207.

[6] Park HK，Kim HK，Kim HG，et al. Expression of peroxisome proliferator activated receptor gamma in prostatic adenocarcinoma [J]. Journal of Korean Medical Science，2015，30（5）：533-541.

[7] 高明.頭頸腫瘤學(xué)[M].北京：科學(xué)技術(shù)文獻出版社，2014.

[8] 高明.甲狀腺結(jié)節(jié)和分化型甲狀腺癌診治指南[J].中華核醫(yī)學(xué)與分子影像雜志，2013，33（2）：1249-1272.

[9] Brunello AG，Weissenberger J，Kappeler A，et al. Astrocytic alterations in interleukin-6/soluble interleukin-6 receptor α double-transgenic mice [J]. American Journal of Pathology，2000，157（5）：1485-1493.

[10] Ho AS，Louise Davies MD，Nixon IJ，et al. Increasing diagnosis of subclinical thyroid cancers leads to spurious improvements in survival rates [J]. Cancer，2015，121（11）：1793-1799.

[11] Jiang L，Chu H，Zheng H. B-Raf mutation and papillary thyroid carcinoma patients [J]. Oncology Letters，2016，11（4）：2699-2705.

[12] Gustafson KS，Livolsi VA，F(xiàn)urth EE，et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma expression in follicular-patterned thyroid lesions. Caveats for the use of immunohistochemical studies [J]. American Journal of Clinical Pathology，2003，120（2）：175-181.

[13] Galusca B，Dumollard JM，Chambonniere ML，et al. Peroxisome proliferator activated receptor gamma immunohistochemical expression in human papillary thyroid carcinoma tissues. Possible relationship to lymph node metastasis [J]. Anticancer Research，2004，24（3b）：1993-1997.

[14] Copland JA，Marlow LA，Kurakata S，et al. Novel high-affinity PPARgamma agonist alone and in combination with paclitaxel inhibits human anaplastic thyroid carcinoma tumor growth via p21WAF1/CIP1 [J]. Oncogene，2006， 25（16）：2304-2317.

[15] Kato Y，Ying H，Zhao L，et al. PPAR[gamma] insufficiency promotes follicular thyroid carcinogenesis via activation of the nuclear factor-[kappa] B signaling pathway [J]. Oncogene，2006，25（19）：2736-2747.

[16] Wood WM，Sharma V，Bauerle KT，et al. PPARgamma promotes growth and invasion of thyroid cancer cells [J]. Ppar Research，2011，2011（5）：1-11.

[17] Kroll TG，Sarraf P，Pecciarini L，et al. PAX8-PPAR-γ1 fusion in oncogene human thyroid carcinoma [J]. Science，2000，289（5483）：1357-1360.

[18] Giordano TJ，Au AY，Kuick R，et al. Delineation，functional validation，and bioinformatic evaluation of gene expression in thyroid follicular carcinomas with the PAX8-PPARG translocation [J]. Clin Cancer Res，2006，12（7 Pt 1）：1983-1993.

[19] Vanden Heuvel JP. Peroxisome proliferator-activated receptors：a critical link among fatty acids，gene expression and carcinogenesis [J]. Journal of Nutrition，1999，129（2S Suppl）：575S-580S.

[20] Castro P，Rebocho AP，Soares RJ，et al. PAX8-PPARgamma rearrangement is frequently detected in the follicular variant of papillary thyroid carcinoma [J]. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism，2006，91（91）：213-220.

（收稿日期：2016-07-14 本文編輯：張瑜杰）