黃丁丁+翁浩+劉榮+徐志勇+劉海健

[摘要] 目的 評(píng)價(jià)Janus激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（JAK2/STAT3）信號(hào)通路在依達(dá)拉奉抑制大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞缺血再灌注損傷后腦損傷中的作用。 方法 體外培養(yǎng)SD乳鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為常規(guī)培養(yǎng)組（C組）、糖氧剝奪組（OGD組）、依達(dá)拉奉組（EDA組）。OGD組小膠質(zhì)細(xì)胞糖氧剝奪6 h，再灌注12 h建立缺血再灌注損傷模型；EDA組細(xì)胞糖氧剝奪后加入含EDA（濃度50 μmol/L）的正常培養(yǎng)基后處理12 h。采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞存活率的變化；Western blot法檢測(cè)JAK2蛋白磷酸化（p-JAK2）、STAT3蛋白磷酸化（p-STAT3）變化；ELISA法檢測(cè)IL-1β和IL-6的變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果 與C組比較，OGD組細(xì)胞存活率降低，p-JIK2和p-STAT3的表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-6濃度增加，細(xì)胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與OGD組比較，EDA組細(xì)胞存活率增加，p-JAK2和p-STAT3表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞上清液的IL-1β和IL-6濃度減少，細(xì)胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 依達(dá)拉奉后處理抑制大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞缺血再灌注損傷后炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡與JAK2/STAT3信號(hào)通路部分相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 依達(dá)拉奉；小膠質(zhì)細(xì)胞；STAT3轉(zhuǎn)錄因子；腦損傷

[中圖分類(lèi)號(hào)] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）11（a）-0016-04

依達(dá)拉奉是氧自由基清除劑之一，可以減輕腦缺血再灌注的損傷，改善臨床預(yù)后[1-4]。蛋白質(zhì)酪氨酸激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（JAK2/STAT3）信號(hào)通路是通過(guò)可溶性信號(hào)分子激活，參與細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過(guò)程[5]。動(dòng)物整體水平研究表明，依達(dá)拉奉通過(guò)可以調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號(hào)通路減輕腦缺血再灌注損傷后半暗帶區(qū)炎性反應(yīng)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡[6]。而小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)起著重要作用。本研究擬觀(guān)察依達(dá)拉奉是否通過(guò)調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制小膠質(zhì)細(xì)胞缺血再灌注損傷后的炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是出生24 h內(nèi)SD乳鼠，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：2007000582928。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，依達(dá)拉奉由南京先聲東元制藥有限公司生產(chǎn)（生產(chǎn)批號(hào)：80160306），CCK-8試劑盒購(gòu)自Sigma公司，Anti-CD11b/c購(gòu)自Abcam公司，抗體p-JAK2購(gòu)自Santa Cruz公司，抗體p-STAT3購(gòu)自Cell Signaling公司，ELISA試劑盒購(gòu)自Sigma公司。本研究動(dòng)物試驗(yàn)經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

參照文獻(xiàn)[7]的方法培養(yǎng)原代小膠質(zhì)細(xì)胞，主要步驟如下：在嚴(yán)格無(wú)菌的條件下取新生乳鼠，斷頭，取腦，剪碎腦組織，用胰酶消化，離心后制成細(xì)胞懸液，接種入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)14 d左右，倒掉培養(yǎng)液，用胰酶消化，將含漂浮的小膠質(zhì)細(xì)胞的消化液轉(zhuǎn)入離心管，離心后接種于細(xì)胞培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)，10 min后棄掉不貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。采用溫和消化法[8]分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞純度。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

取純化的小膠質(zhì)細(xì)接種于培養(yǎng)板，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為三組：正常對(duì)照組（C組）、糖氧剝奪組（OGD組）和依達(dá)拉奉組（EDA組）。C組正常培養(yǎng)12 h。OGD組換成不含糖的DMEM培養(yǎng)基并置于5%CO2、1%O2、94%N2培養(yǎng)箱孵育6 h[9]，糖氧剝奪后換成正常培養(yǎng)基并置于正常環(huán)境下細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h用于實(shí)驗(yàn)。EDA組在糖氧剝奪后將培養(yǎng)基換成含依達(dá)拉奉（50 μmol/L）的正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 指標(biāo)觀(guān)察

1.4.1 細(xì)胞存活率檢測(cè) 采用CCK8法對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行活力檢測(cè)，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm處吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率（%）=（加藥組吸光值-空白對(duì)照組吸光值）/（不加藥組吸光值-空白對(duì)照組）×100%。

1.4.2 小膠質(zhì)細(xì)胞p-JAK2蛋白和p-STAT3蛋白水平檢測(cè) 采用蛋白質(zhì)免疫印跡分析（Western blot）。參照細(xì)胞質(zhì)蛋白提取方法，將各組細(xì)胞離心收集后，經(jīng)裂解高速離心，吸取上清液并加入上樣緩存液混勻后，煮沸8 min，按照試劑盒操作要求，行聚丙酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，用脫脂奶粉室溫下封閉1 h，然后加入一抗p-JAK2和p-STAT3，4℃孵育過(guò)夜，然后加入二抗孵育，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，采用凝膠分析軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白條光密度值與內(nèi)參條帶光密度值的比值反應(yīng)目的蛋白表達(dá)水平。

1.4.3 IL-1β和IL-6水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-1β和IL-6水平。實(shí)驗(yàn)操按照說(shuō)明書(shū)流程操作，每組取10個(gè)培養(yǎng)孔收集小膠質(zhì)細(xì)胞上清液，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)IL-1β和IL-6濃度。

1.4.4 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 各組小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，使用流式細(xì)胞儀采用Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率，按照試劑盒說(shuō)明操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定

經(jīng)CD11b/c抗體處理后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞純度，同型陰性對(duì)照CD11b/c陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占3.26%（圖1A），CD11b/c抗體標(biāo)記后陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為79.08%。

2.3 三組小膠質(zhì)細(xì)胞p-JAK2和p-STAT3蛋白水平比較

與C組比較，OGD組細(xì)胞p-JAK2蛋白和p-STAT3蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P < 0.05）；與OGD組比較，EDA組細(xì)胞p-JAK2蛋白和p-STAT3蛋白表達(dá)減弱（P < 0.05）。

3 討論

本實(shí)使用CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞純度，結(jié)果表明細(xì)胞活性正常，小膠質(zhì)細(xì)胞純度達(dá)到細(xì)胞實(shí)驗(yàn)要求。本課題組參照前期研究結(jié)果[10-11]，使用CCK-8試劑盒計(jì)算依達(dá)拉奉后處理在糖氧剝奪下對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）為119.9 μmol/L，因此本實(shí)驗(yàn)選擇依達(dá)拉奉I(lǐng)C50的1/3～1/2即50 μmol/L作為實(shí)驗(yàn)濃度。

本研究結(jié)果表明，依達(dá)拉奉后處理給藥可以增加小膠質(zhì)細(xì)胞缺血再灌注損傷后細(xì)胞存活率，抑制p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)，降低炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6水平，減少小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，推測(cè)依達(dá)拉奉抑制腦缺血再灌注損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡與JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)。

謝慧芳等[12]的研究結(jié)果表明，依達(dá)拉奉可以抑制大鼠局灶性缺血再灌注損傷后半暗帶區(qū)JAK2和STAT3蛋白磷酸化表達(dá)，減輕炎性反應(yīng)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善大鼠的神經(jīng)功能的缺失。有研究結(jié)果表明，JAK2/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路參與了大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，抑制JAK2/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路可以減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng)，減輕了細(xì)胞凋亡[13-20]。推測(cè)依達(dá)拉奉通過(guò)減少小膠質(zhì)細(xì)胞缺血再灌注后氧自由基釋放，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少I(mǎi)L-1β和IL-6大量釋放，進(jìn)而抑制了IL-1β和IL-6引起的一系列炎性反應(yīng)引發(fā)的細(xì)胞凋亡，且JAK2/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路參與了上述依達(dá)拉奉的神經(jīng)保護(hù)過(guò)程。因此，通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)JAK2/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路可能在減輕全腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要作用。

綜上所述，JAK2/STAT3信號(hào)通路參與了依達(dá)拉奉后處理抑制大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞缺血再灌注損傷后炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的過(guò)程。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Nakamoto H，Aihara Y，Yamaguchi K，et al. Efficacy，safety，and outcomes in 17 pediatric cases treated with the free radical scavenger edaravone [J]. Childs Nerv Syst，2015， 31（9）：1533-1540.

[2] Qin T，Lei LY，Li N，et al. Edaravone improves survival and neurological outcomes after cardiopulmonary resuscitation in a ventricular fibrillation model of rats [J]. Am J Emerg Med，2016，16（3）：30334-30335.

[3] Sun YY，Li Y，Wali B，et al. Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury：implications for perioperative neuroprotection [J]. Stroke，2015， 46（7）：1947-1955.

[4] 張自豪，裴凌.依達(dá)拉奉對(duì)內(nèi)毒素休克大鼠海馬細(xì)胞凋亡的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志，2015，35（7）：861-865.

[5] Dong W，Xian Y，Yuan W，et al. Catalpol stimulates VEGF production via the JAK2/STAT3 pathway to improve angiogenesis in rats' stroke modes [J]. J Ethnopharmacol，2016，15（191）：169-179.

[6] 趙彬，王玉芳，陳桂華，等.依達(dá)拉奉對(duì)腦山血大鼠血腫周?chē)M織NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，11 （15）：17-19.

[7] 張思思，蔡江暉，萬(wàn)敬員，等.羥基積雪草苷對(duì)LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖的抑制作用及機(jī)制研究[J].中國(guó)病理生理學(xué)雜志，2015，31（3）：428-434.

[8] 王寶萍，李東風(fēng)，徐書(shū)雯.原代小膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元培養(yǎng)不同純化方法的比較[J].廣東醫(yī)學(xué)，2012，33（6）：723-725.

[9] 彭晴霞，楊碧瑩，潘經(jīng)銳，等.氧葡萄糖剝奪-再恢復(fù)后抑制小膠質(zhì)細(xì)胞TLR9激活對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用[J].中國(guó)病理生理雜志，2015，31（3）：403-408.

[10] 黃丁丁，王迪芬，周曉峰，等.不同濃度依達(dá)拉奉預(yù)處理對(duì)新生大鼠腦片谷氨酸損傷的保護(hù)作用[J].貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，37（2）：120-126.

[11] 周曉峰，黃丁丁，王迪芬，等.丙泊酚預(yù)處理對(duì)谷氨酸損傷大鼠腦組織的保護(hù)作用研究[J].中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué)，2012，24（12）：750-753.

[12] 謝惠芳，徐如祥，魏繼鵬，等.依達(dá)拉奉對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響[J].廣東醫(yī)學(xué)，2007，28（7）：1043-1045.

[13] Zeng KW，Yu Q，Liao LX，et al. Anti-Neuroinflammatory Effect of MC13，a Novel Coumarin Compound From Condiment Murraya，Through Inhibiting Lipopolysaccha？鄄ride-Induced TRAF6-TAK1-NF-κB，P38/ERK MAPKS and Jak2-Stat1/Stat3 Pathways [J]. J Cell Biochem，2015， 11 6（7）：1286-1299.

[14] Song F，Zeng K，Liao L，et al. Schizandrin A Inhibits Microglia-Mediated Neuroninflammation through Inhibi？鄄ting TRAF6-NF-κB and Jak2-Stat3 Signaling Pathways [J]. Plos One，2016，11（2）：e0149991.

[15] Mao J，Yang J，Zhang Y，et al. Arsenic trioxide mediates HAPI microglia inflammatory response and subsequent neuron apoptosis through p38/JNK MAPK/STAT3 pathway [J]. Toxicol Appl Pharmacol，2016，15 （303）：79-89.

[16] 趙博，冷燕，吳曉靜，等.JAK2/STAT3信號(hào)通路在糖尿病大鼠心肌缺血再灌注誘發(fā)腦損傷中的作用[J].中華麻醉學(xué)雜志，2016，36 （2）：211-214.

[17] 陳真珍，王凱華，黃龍堅(jiān)，等.JAK2/STAT3信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷中的作用[J].中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2013，16 （10）：29-31.

[18] Qin H，Buckley JA，Li X，et al. Inhibition of the JAK/STAT Pathway Protects Against α-Synuclein-Induced Neuroin？鄄flammation and Dopaminergic Neurodegeneration [J]. J Neur？鄄osci，2016，36 （18）：5144-5159.

[19] O′Callaghan JP，Kelly KA，VanGilder RL，et al. Early Activation of STAT3 Regulates Reactive Astrogliosis Induced by Diverse Forms of Neurotoxicity [J]. Plos One，2014，9 （7）：e102003.

[20] Lu Y，He M，Xu S，et al. Differential pro-inflammatory responses of astrocytes and microglia involes STAT3 activation in response to 1800MHz radiofrequency fields [J]. Plos One，2014，9（9）：e108318.

（收稿日期：2016-08-04 本文編輯：程 銘）