王鑫++++++王巍++++++張君丞++++++賈大林

[摘要] 目的 觀察原花青素（PCs）通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)H9C2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（H/R）后損傷的保護(hù)作用。方法 將培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、缺氧/復(fù)氧組（H/R組）、低劑量PCs+H/R組（LPCs組）、中劑量PCs+缺氧復(fù)氧組（MPCs組）、高劑量PCs+缺氧復(fù)氧組（HPCs組）。對(duì)照組心肌細(xì)胞正常培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，H/R組行缺氧3 h后復(fù)氧3 h，PCs組分別于缺氧前30 min給予50、100、200 μg/mL 的PCs培養(yǎng)再行缺氧/復(fù)氧過(guò)程。實(shí)驗(yàn)后MTT法測(cè)定細(xì)胞生存率；測(cè)定乳酸脫氫酶（LDH）活性；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡；Western blot測(cè)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（CHOP）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）、Caspase-12的表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組比較，H/R組細(xì)胞生存率顯著降低（P < 0.05），LDH活性和細(xì)胞凋亡率顯著升高（P < 0.05）；H/R組GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增加（P < 0.05）；給予不同濃度PCs干預(yù)后，PCs預(yù)處理組細(xì)胞生存率較H/R組明顯升高（LPCs組除外），LDH活性和細(xì)胞凋亡率明顯降低（P < 0.05），PCs預(yù)處理組GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12蛋白表達(dá)較H/R組明顯下降（P < 0.05），中高劑量PCs抑制作用較低劑量強(qiáng)（P < 0.05）。結(jié)論 H/R可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，引起細(xì)胞損傷和凋亡；PCs可以通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮其保護(hù)作用，減少細(xì)胞損傷和凋亡。

[關(guān)鍵詞] 原花青素；H9C2心肌細(xì)胞；缺氧/復(fù)氧；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

[中圖分類號(hào)] R542 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）11（b）-0029-05

[Abstract] Objective To observe the protective effect of proanthocyanidins （PCs） on hypoxia/reoxygenation （H/R） injury by attenuating endoplasmic reticulum stress （ERS） in H9C2 cardiomyocytes. Methods The H9C2 cardiomyocytes were randomly divided into five groups： control group， hypoxia/reoxygenation group （H/R group）， low-dose PCs+H/R group （LPCs group）， middle-dose PCs+H/R group （MPCs group）， high-dose PCs+H/R group （HPCs group）. H9C2 cardiomyocytes of control group were cultured under normal condition till the end of experiment. Cardiomyocytes of H/R group underwent hypoxia for 3 hours followed by reoxygenation for 3 hours. Different doses of PCs （50， 100， 200 μg/mL） were given 30 minutes before hypoxia in the PCs groups. Cell viability by MTT， lactic dehydrogenase （LDH） activity， cell apoptosis ratio by flow cytometric measurement and the protein expression of glucose-regulated proteins 78 （GRP78）， C/EBP-homologous protein（CHOP）， phosphorylation of c-Jun-N-terminal protein kinase（p-JNK） and Caspase-12 were detected. Results Compared with the control group， cell viability decreased significantly and LDH activity and apoptosis ratio increased significantly in the H/R group （P<0.05）， coupled with obvious increased expression of GRP78， CHOP， p-JNK， Caspase-12 protein （P < 0.05）. Different doses of PCs pretreatment increased cell viability （except the LPCs group）， decreased LDH activity and apoptosis ratio （P < 0.05） as well as decreased expression of GRP78， CHOP， p-JNK， Caspase-12 protein compared to the H/R group （P < 0.05）. Middle and high dose PCs pretreatment showed more effect than low dose group. Conclusion H/R can induce ERS leading to cell injury and apoptosis. PCs can protect cardiomyocytes against H/R injury by inhibiting ERS.

[Key words] Proanthocyanidins； H9C2 cardiomyocytes； Hypoxia/reoxygenation； Endoplasmic reticulum stress

缺血/再灌注損傷會(huì)引起組織功能紊亂甚至細(xì)胞凋亡[1-2]，如何有效預(yù)防心肌缺血/再灌注損傷是近年來(lái)冠心病治療的熱點(diǎn)問(wèn)題[3]。越來(lái)越多的研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）在缺血/再灌注損傷的病理過(guò)程中起重要作用[4]。早期ERS可通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白合成促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)，而持續(xù)的ERS則會(huì)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡通路：CHOP、JNK、Caspase-12，引起細(xì)胞凋亡[5]。原花青素（PCs）是從植物中提取的一類具有多種生物活性的多酚類化合物，已被證實(shí)對(duì)心肌缺血/再灌注損傷有保護(hù)作用[6]，但PCs是否通過(guò)抑制ERS來(lái)減輕再灌注損傷及細(xì)胞凋亡未有文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用H9C2心肌細(xì)胞建立缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型，模擬心肌缺血/再灌注損傷，在細(xì)胞水平觀察PCs對(duì)心肌細(xì)胞H/R損傷的保護(hù)作用，同時(shí)檢測(cè)ERS凋亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，為保護(hù)心肌缺血/再灌注損傷提供藥物防治理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與藥物

H9C2心肌細(xì)胞株（購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)），PCs（購(gòu)自上海Aladdin科技公司，純度≥95%）。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（Hyclone），PBS緩沖液（雙螺旋），胰蛋白酶（碧云天），MTT試劑盒（Sigma），細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、GRP78、CHOP、p-JNK抗體（沈陽(yáng)萬(wàn)類生物公司），Caspase-12抗體（Santa Cruze CA，USA），乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定試劑盒（南京建成公司），CO2培養(yǎng)箱（HF-90），流式細(xì)胞儀（C6，美國(guó)BD公司），凝膠成像系統(tǒng)（WD-9413B，北京六一公司），雙垂直蛋白電泳儀（DYCZ-24DN），酶標(biāo)儀（ELX-800）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將實(shí)驗(yàn)用H9C2心肌細(xì)胞分為5組，①對(duì)照組：心肌細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在95%空氣+5%CO2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)正常培養(yǎng)6 h；②H/R組：將心肌細(xì)胞置換到無(wú)糖無(wú)血清、缺氧的DMEM培養(yǎng)基（氮?dú)忸A(yù)缺氧處理10 min），置于37℃充滿95%N2和5%CO2的三氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 h，然后更換為正常培養(yǎng)基，置于95%空氣+5%CO2的37℃培養(yǎng)箱復(fù)氧培養(yǎng)3 h。③④⑤不同濃度PCs預(yù)處理組：分別加入50 μg/mL（LPCs組）、100 μg/mL（MPCs組）、200 μg/mL（HPCs組）PCs對(duì)心肌細(xì)胞預(yù)處理30 min，后行H/R（同H/R組）。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

將H9C2組細(xì)胞培養(yǎng)至密度為90%左右，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按實(shí)驗(yàn)分組接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔的細(xì)胞個(gè)數(shù)為5×103個(gè)，每組設(shè)計(jì)5個(gè)復(fù)孔，接種后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組按照上述方法分別處理后加入5 mg/mL的MTT，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，小心吸去上清，加入200 μL DMSO以溶解細(xì)胞形成的紫色結(jié)晶，在酶標(biāo)儀上測(cè)定其在490 nm處OD值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD×100%，重復(fù)測(cè)定5次。

1.5 LDH測(cè)定

將LDH試劑盒中NaOH與丙酮酸稀釋10倍，分別配制為0.4 mol/L NaOH溶液與0.2 μmol/mL丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液；取各組細(xì)胞上清液為待測(cè)樣品，與試劑盒中適量的底物緩沖液、輔酶及0.2 μmol/mL丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液、蒸餾水混勻，37℃水浴15 min；加入適量2，4-二硝基苯肼混勻，37℃水浴15 min；加入適量0.4 mol/L NaOH溶液混勻，室溫放置5 min，在酶標(biāo)儀上測(cè)定其在450 nm處的OD值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

細(xì)胞按不同分組要求處理后，收集細(xì)胞，去上清，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，再離心去上清，每管細(xì)胞樣品中加入500 μL Binding Buffer輕輕重懸細(xì)胞，后加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL Propidium Iodide混勻，室溫避光孵育15 min，隨即進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.7 Western blot檢測(cè)

收集細(xì)胞提取蛋白，通過(guò)BCA反應(yīng)測(cè)定蛋白濃度。取樣本蛋白40 μg，以8%～13%聚丙烯酰胺凝膠（SDS）電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)印、封閉后，依次加入一抗（羊抗兔GRP78抗體1∶500，羊抗兔CHOP抗體1∶500，羊抗兔p-JNK抗體1∶500，羊抗兔Caspase-12抗體1∶1000）4℃孵育過(guò)夜，加入二抗37℃孵育45 min，加入ECL發(fā)光液靜置5 min，用凝膠圖象處理系統(tǒng)（Gel-Pro-Analyzer軟件）分析目標(biāo)條帶的光密度值。β-actin為內(nèi)參照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCs預(yù)處理提高H/R損傷后心肌細(xì)胞存活率，減少心肌細(xì)胞LDH釋放

與對(duì)照組比較，H/R組細(xì)胞存活率明顯降低（P < 0.05），LDH活性明顯升高（P < 0.05）。與H/R組相比，MPCs、HPCs組心肌細(xì)胞存活率顯著提高（P < 0.05），LPCs組改善作用不明顯（P > 0.05），其中MPCs組細(xì)胞存活率提高最多。不同濃度PCs預(yù)處理組的LDH活性明顯低于H/R組（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 PCs預(yù)處理可減少H/R后心肌細(xì)胞凋亡

對(duì)照組細(xì)胞凋亡極少，而H/R組出現(xiàn)大量凋亡和壞死細(xì)胞，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與H/R組比較，不同濃度PCs預(yù)處理后細(xì)胞凋亡及壞死均明顯減少（P < 0.05），MPCs組細(xì)胞凋亡減少最明顯。見(jiàn)圖1。

2.3 PCs預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞ERS相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

H/R組GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高（P < 0.05）；給予不同濃度PCs干預(yù)后，GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12蛋白表達(dá)水平下降（P < 0.05），MPCs、HPCs組GRP78、CHOP、p-JNK蛋白表達(dá)低于LPCs組，HPCs組Caspase-12蛋白表達(dá)低于LPCs組（P < 0.05）。見(jiàn)圖2。

3 討論

本研究主要發(fā)現(xiàn)PCs可以通過(guò)減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮對(duì)H/R心肌細(xì)胞的顯著保護(hù)作用，這種作用非劑量依賴性，本研究PCs最佳保護(hù)濃度測(cè)定為100 μg/mL。

PCs是植物中廣泛存在的一類多酚類化合物，由兒茶素或表兒茶素形成的二聚體或多聚體。在眾多植物中，葡萄籽提取物中的PCs的含量最高。PCs是強(qiáng)效的天然抗氧化物，其清除氧自由基的能力遠(yuǎn)超過(guò)維生素C、維生素E或β胡蘿卜素[7]。PCs具有眾多生物活性，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)心血管作用等[8-11]。PCs可以通過(guò)清除氧自由基和減輕線粒體凋亡通路減輕心肌缺血/再灌注損傷[12-13]，但目前尚未報(bào)道證實(shí)PCs通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡通路保護(hù)H/R心肌細(xì)胞。

ERS指的是在各種不良刺激下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)被破壞、功能發(fā)生紊亂，使大量錯(cuò)誤折疊、未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)累積及鈣平衡紊亂的過(guò)程[14]。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白，其表達(dá)上調(diào)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活的標(biāo)志[15]。早期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，GRP78結(jié)合未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白，通過(guò)減少蛋白合成、增加促進(jìn)蛋白正確折疊的分子伴侶的表達(dá)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解來(lái)減輕ERS并促進(jìn)細(xì)胞恢復(fù)[16]。如果應(yīng)激嚴(yán)重或持續(xù)存在，則會(huì)誘導(dǎo)ERS相關(guān)性細(xì)胞凋亡，造成組織細(xì)胞損傷，主要包括CHOP、JNK和Caspase-12凋亡通路的激活[17]。

本研究中，H/R組的心肌細(xì)胞存活率明顯降低，LDH活性和細(xì)胞凋亡率明顯升高，GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，均說(shuō)明H/R對(duì)心肌細(xì)胞造成明顯損傷并激活了ERS及其凋亡通路。PCs預(yù)處理顯著提高了心肌細(xì)胞存活率，減少了LDH釋放和細(xì)胞凋亡，下調(diào)了ERS相關(guān)蛋白表達(dá)，說(shuō)明PCs對(duì)H/R心肌細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，100 μg/mL劑量PCs保護(hù)作用優(yōu)于50、200 μg/mL劑量組，說(shuō)明這種保護(hù)作用不隨濃度增加而增強(qiáng)。法國(guó)科學(xué)院曾報(bào)告PCs抗氧化活性在一定濃度內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性，但如果超出一定濃度，其抗氧化活性隨濃度升高而降低[18]。余瑩等[19]發(fā)現(xiàn)，PCs清除羥基自由基的能力在10 g/L以內(nèi)隨濃度增加幾乎呈直線上升，超過(guò)20 g/L后不再增加。另一方面，劉暢等[20]觀察PCs對(duì)腦缺血影響中報(bào)道，50～200 mg/（kg·d）的PCs呈劑量依賴性減少大鼠腦缺血后自由基生成；何佳聲等[21]研究PCs對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響中發(fā)現(xiàn)，20～80 μg/mL的PCs呈劑量依賴性抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并促凋亡，與本文研究結(jié)果不一致，考慮本研究中高劑量組PCs濃度已超過(guò)PCs對(duì)心肌細(xì)胞的最佳保護(hù)濃度，故保護(hù)作用呈降低趨勢(shì)。目前PCs對(duì)心肌缺血/再灌注損傷研究中未見(jiàn)濃度研究的報(bào)道。

本文從細(xì)胞水平證實(shí)了PCs預(yù)處理可通過(guò)抑制ERS減少H/R引起的細(xì)胞損傷和凋亡，為缺血再灌注損傷的藥物預(yù)防提供了理論基礎(chǔ)。本文不足之處在于H9C2心肌細(xì)胞無(wú)自發(fā)性收縮，不能充分模擬人類心肌細(xì)胞條件，有待于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

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