李潔劉西鋒

1西北師范大學(xué)體育學(xué)院（甘肅 蘭州 730070）2西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院

不同海拔高度交替低氧訓(xùn)練對大鼠骨骼肌線粒體呼吸功能的影響

李潔1劉西鋒2

1西北師范大學(xué)體育學(xué)院（甘肅 蘭州 730070）2西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院

目的：探討不同海拔高度交替低氧訓(xùn)練對大鼠骨骼肌線粒體呼吸功能的影響。方法：50只雄性Wistar大鼠隨機分為5組：常氧對照組（C組）、常氧訓(xùn)練組（NT組）、2500 m低氧訓(xùn)練組（2500 m HT組）、3500 m低氧訓(xùn)練組（3500 m HT組）、2500 m～3500 m交替低氧訓(xùn)練組（2500 m～3500 m HT組），每組10只。除C組大鼠不進行運動訓(xùn)練外，其余各組大鼠分別在常氧，模擬海拔2500m、3500 m及2500 m～3500 m交替環(huán)境下進行遞增負荷跑臺訓(xùn)練和居住，每周訓(xùn)練6天，共4周。訓(xùn)練結(jié)束后處死大鼠，即刻取全血和骨骼肌樣本，梯度離心法提取線粒體，測定血液紅細胞數(shù)目（RBC）、血紅蛋白（Hb）含量和骨骼肌線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體（CⅠ～Ⅳ）活性。結(jié)果：（1）RBC和Hb：與C組比較，各訓(xùn)練組都有顯著提高（P＜0.01，P＜0.05）。與NT組比較，低氧訓(xùn)練組都有顯著提高（P＜0.01）。與2500 m HT組和3500 m HT組比較，2500 m～3500 m HT組均顯著提高（P＜0.01）。（2）CⅠ～Ⅳ活性：與C組相比，NT組CⅢ活性顯著提高（P＜0.05），2500 m HT組CI活性顯著提高（P＜0.05），3500 m HT組CⅠ和CⅢ活性顯著提高（P＜0.01，P＜0.05），2500 m～3500 m HT組CⅠ～Ⅳ活性均顯著提高（P＜0.01，P＜0.05）。與NT組相比，3500 m HT組CⅠ活性顯著提高（P＜0.01），2500 m～3500 m HT組CⅠ、CⅡ活性顯著提高（P＜0.01，P＜0.05）。與2500 m HT組相比，2500 m～3500 m HT組CⅡ活性顯著提高（P＜0.05）。結(jié)論：低氧訓(xùn)練在提高骨骼肌線粒體呼吸鏈功能方面較常氧訓(xùn)練更具優(yōu)勢，且交替低氧訓(xùn)練效果最佳。

交替低氧訓(xùn)練；骨骼??；線粒體；呼吸鏈；酶活性；血液

近些年來，隨著競技體育水平的不斷提高，模擬低氧訓(xùn)練作為一種輔助訓(xùn)練手段已經(jīng)被廣泛運用。然而有學(xué)者提出讓運動員長時間在同一海拔訓(xùn)練，運動員機體已經(jīng)對該海拔缺氧刺激產(chǎn)生適應(yīng)，使得運動員對該海拔高度缺氧刺激不敏感。為增強機體對缺氧的敏感性，產(chǎn)生了低氧交替訓(xùn)練的理論[1]，其主要包括高—高交替訓(xùn)練和高—平交替訓(xùn)練兩種。骨骼肌是人體重要的運動和代謝器官，而線粒體是真核細胞氧化磷酸化的場所，在機體細胞正常能量代謝中有著重要意義。本研究應(yīng)用人工低壓低氧艙，模擬低氧訓(xùn)練，探討不同海拔高度交替低氧訓(xùn)練對大鼠骨骼肌線粒體呼吸功能的影響，為尋求科學(xué)有效的低氧訓(xùn)練方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

雄性健康2月齡Wistar大鼠60只，體質(zhì)量130 g左右，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證：SCXK（甘）2011-0001，動物使用許可證：SYXK（甘）2011-0001。常規(guī)飼喂。經(jīng)篩選將50只大鼠隨機分為5組：常氧對照組（C組）、常氧訓(xùn)練組（NT組）、2500 m低氧訓(xùn)練組（2500m HT組）、3500 m低氧訓(xùn)練組（3500 m HT組）、2500 m～3500 m交替低氧訓(xùn)練組（2500 m～3500 m HT組），每組10只。常氧對照組在常氧環(huán)境中飼養(yǎng)，不進行運動訓(xùn)練；其他各組進行每天一次的水平跑臺遞增負荷訓(xùn)練，每周訓(xùn)練6天，休息1天，共訓(xùn)練4周，具體居住、訓(xùn)練環(huán)境及訓(xùn)練方案如表1所示。

表1 各組大鼠訓(xùn)練方案

1.2 低壓低氧艙

用厚12 mm透明有機玻璃板制成一封閉艙（130× 70×55 cm3，可放入動物跑臺），安裝通入艙內(nèi)的抽氣閥和進氣閥，然后與真空泵相連，開啟真空泵，不斷抽出艙內(nèi)氣體，造成艙內(nèi)低氣壓。操縱氣閥，調(diào)節(jié)抽氣和進氣的比例，使艙內(nèi)形成模擬海拔2500 m及3500 m海拔的低壓低氧環(huán)境[2]。艙內(nèi)壓力用標準海拔表校正。

1.3 取材及線粒體制備

訓(xùn)練方案結(jié)束后，所有大鼠在常氧環(huán)境恢復(fù)生活2天，按0.3 ml／100 g體重劑量，腹腔注射10%水合三氯乙醛溶液麻醉大鼠，腹主動脈取全血待測。然后于冰盤上迅速取出股四頭肌，在冷生理鹽水中除去脂肪等結(jié)締組織后，置于液氮中冷凍，-20℃低溫保存待用。

將低溫保存樣本取出，自然融化，在冰浴中將股四頭肌剪成碎塊，并按重量體積比1：5加入勻漿緩沖液（緩沖液組成：0.1 mol/L KCl、5 mmol/L Tris-Hcl、pH 7.4），電動勻漿器勻漿（勻漿30 s，間隔30 s，反復(fù)3次）。勻漿液2000 r/min離心15 min，取上清液，將沉淀按重量體積比1：5加入緩沖液懸浮，2000 r/min離心15 min，取上清，將兩次上清混合，12000 r/min離心15 min，棄上清，所得沉淀加入適量緩沖液，充分混合后，12000 r/min離心15 min，所得沉淀物即為線粒體[3]。線粒體分離過程全部在0～4℃下進行。將制備的線粒體用懸浮液（30 mmol/L蔗糖、20 mmol/L Tris-Hcl、0.1%BSA、pH 7.2）懸浮待用。

1.4 指標測試方法

使用全血分析儀測定血液紅細胞（RBC）數(shù)及血紅蛋白（Hb）含量。

以牛血清白蛋白為標準，用考馬斯亮藍法測定線粒體蛋白質(zhì)含量。

參照Vyatkina的方法[4]進行線粒體酶復(fù)合體（CⅠ～Ⅳ）活性的測定。將10～20 μg的線粒體蛋白加入到終體積為2 mL的緩沖液中，以蒸餾水作空白管，校正吸光度值到0點，分別測定波長340、550、600 nm處3 min吸光度值的變化。酶活性單位為μmol·mg protein-1·min-1。

1.5 主要儀器

低壓低氧艙（自制），海拔表（德國），DSPT-202型動物跑臺（中國杭州錢江科工貿(mào)公司制造），YQ-3型電動勻漿機（江蘇金壇市儀表儀器廠），UVmimi-1240島津紫外可見光分光光度計（日本島津精密科學(xué)儀器有限公司），Universal 32R低溫高速離心機（德國）。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

所有實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示，組間用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血液指標的比較

紅細胞數(shù)目：與C組比較，NT組、2500 m HT組、3500 m HT和2500 m～3500 m HT組均顯著提高（P＜0.05，P＜0.01）；與NT組比較，2500 m HT組、3500 m HT和2500 m～3500 m HT組均顯著提高（P＜0.01）；與2500 m HT組比較，3500 m HT組無顯著性提高，2500 m～3500 m HT組顯著提高（P＜0.01）；與3500 m HT組比較，2500 m～3500 m HT組顯著（P＜0.01）提高。見表2。

血紅蛋白含量：與C組相比，NT組、2500 m HT組、3500 m HT和2500 m～3500 m HT組均顯著提高（P＜0.05，P＜0.01）；與NT組相比，2500 m HT組、3500 m HT和2500 m～3500 m HT組均顯著提高（P＜ 0.01）；與2500 m HT組相比，3500 m HT組無顯著性提高，2500 m～3500 m HT組顯著提高（P＜0.01）；與3500 m HT組相比，2500 m～3500 m HT組顯著（P＜0.01）提高。見表2。

表2 各組大鼠RBC數(shù)、Hb含量比較（n=10）

2.2 各組提取線粒體蛋白質(zhì)含量

提取的各組線粒體蛋白質(zhì)含量分別為（μg/ml）：C組1459.31，NT組1279.03，2500 m HT組1186.37，3500 m HT組912.61，2500 m～3500 m HT組902.95。

2.3 各組大鼠骨骼肌線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體（ CCⅠ～Ⅳ）活性比較

與C組比較，NT組CⅢ活性顯著提高（P＜0.05），CⅠ、CⅡ和CⅣ活性均提高，但均無顯著性變化；2500 m HT組CⅠ活性顯著提高（P＜0.05），CⅡ、CⅢ和CⅣ活性均提高，但均無顯著性差異；3500 m HT組CⅠ和CⅢ活性顯著提高，（P＜0.01，P＜0.05），CⅡ和CⅣ活性均提高，但均無顯著性差異；2500 m～3500 m HT組CⅠ～CⅣ活性均顯著提高（P＜0.01，P＜0.05）。

與NT組比較，2500 m HT組CⅠ、CⅡ、CⅣ活性均有提高，但均無顯著性差異，CⅢ活性降低，也無顯著性差異；3500 m HT組CⅠ活性顯著提高（P＜0.01），CⅡ和CⅣ活性均提高，但均無顯著性差異，CⅢ活性降低，也無顯著性差異；2500 m～3500 m HT組CⅠ和CⅡ活性顯著提高（P＜0.01，P＜0.05），CⅣ活性提高，CⅢ活性降低，但均無顯著性差異。

與2500 m HT組比較，3500 m HT組CⅠ～Ⅳ活性均提高，但均無顯著性差異；2500 m～3500 m HT組CⅡ顯著提高（P＜0.05），CⅠ、CⅢ和CⅣ活性均提高，但均無顯著性差異。

與3500 m HT組比較，2500 m～3500 m HT組CⅠ、CⅡ和CⅣ活性均提高，CⅢ活性降低，但無顯著性差異。見表3。

表3 各組大鼠骨骼肌線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性比較（各組均n=10，μmol·mg protein-1·min-1）

3 討論

3.1 不同海拔高度交替低氧訓(xùn)練對大鼠血液指標的影響

由本實驗結(jié)果可以看出，常氧訓(xùn)練組RBC相比安靜對照組有一定的升高，低氧訓(xùn)練組的紅細胞數(shù)目顯著高于常氧訓(xùn)練組，在低氧訓(xùn)練組中2500 m～3500 m交替低氧訓(xùn)練組的紅細胞數(shù)目顯著高于2500 m低氧訓(xùn)練組和3500 m低氧訓(xùn)練組。Hb含量的變化趨勢與紅細胞數(shù)量變化趨勢相一致，其由高到低的順序均為：2500 m～3500 m HT組＞3500 m HT組＞2500 m HT組＞NT組＞C組。說明運動訓(xùn)練可以提高機體RBC和Hb含量，低氧刺激加運動訓(xùn)練更有利于提高機體的RBC數(shù)量和Hb含量，且不同海拔的交替低氧訓(xùn)練比固定海拔的低氧訓(xùn)練能進一步提高RBC數(shù)量和Hb含量。已有的研究結(jié)果與本實驗有一致之處，即與常氧訓(xùn)練對照組相比，高住高練組（模擬海拔3500 m高度）大鼠血液RBC、Hb顯著升高[5]。本實驗結(jié)果還得到張纓等研究的支持[6]，其研究發(fā)現(xiàn)氧濃度為14.2%（相當于海拔3000 m所對應(yīng)的氧濃度）的高住高練低訓(xùn)與15.4%（相當于海拔2500 m所對應(yīng)的氧濃度）相比，能更快更有效地提高RBC和Hb的生成。

本實驗結(jié)果說明：常氧運動訓(xùn)練可提高機體RBC和Hb的生成，低氧訓(xùn)練能進一步促進RBC和Hb的生成，且在一定海拔范圍內(nèi)，高海拔比低海拔訓(xùn)練更有效。另外，不同海拔交替低氧訓(xùn)練比固定海拔低氧訓(xùn)練效果更好。

影響氧在體內(nèi)運輸?shù)膬蓚€主要因素是血氧容量和Hb對氧的親和力，RBC的運氧功能主要通過Hb來實現(xiàn)，Hb濃度決定了血液攜帶氧的能力，也影響周圍組織的氧利用。因此，RBC和Hb增加將使血氧容量增加，從而提高機體的運氧能力。本研究結(jié)果顯示，交替低氧訓(xùn)練組大鼠RBC數(shù)量和Hb含量顯著高于3500 m低氧訓(xùn)練組、2500 m低氧訓(xùn)練組及常氧訓(xùn)練組，表明交替低氧訓(xùn)練組大鼠血氧容量升高最為顯著，有利于提高大鼠血液的運氧能力，也促進周圍組織的氧利用。因此，交替低氧訓(xùn)練是提高機體運氧能力較好的訓(xùn)練模式。

3.2 不同海拔高度交替低氧訓(xùn)練對大鼠骨骼肌線粒體呼吸鏈酶活性的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，4周遞增負荷訓(xùn)練后，常氧訓(xùn)練組、2500 m低氧訓(xùn)練組、3500 m低氧訓(xùn)練組及2500 m～3500 m交替低氧訓(xùn)練組大鼠股四頭肌線粒體呼吸鏈CⅠ～CⅣ活性均高于常氧對照組，表明不論是常氧環(huán)境還是低氧環(huán)境，運動訓(xùn)練均可提高大鼠骨骼肌線粒體呼吸功能。與常氧訓(xùn)練組相比，除CⅢ活性無顯著性降低外，2500 m低氧訓(xùn)練組、3500 m低氧訓(xùn)練組及2500 m～3500 m交替低氧訓(xùn)練組呼吸鏈CⅠ、CⅡ、CⅣ均有提高，其中CⅠ活性在3500m低氧訓(xùn)練組和2500 m～3500 m交替低氧訓(xùn)練組顯著提高，CⅡ活性在2500 m～3500 m交替低氧訓(xùn)練組顯著提高。CⅣ活性在2500 m低氧訓(xùn)練組、3500 m低氧訓(xùn)練組及2500 m～3500 m交替低氧訓(xùn)練組均無顯著性提高。這表明在改善線粒體呼吸鏈功能方面，低氧訓(xùn)練較常氧訓(xùn)練更有效。已有研究表明，模擬海拔2500 m高度低氧訓(xùn)練4周，低氧訓(xùn)練組大鼠股四頭肌琥珀酸脫氫酶（SDH）活性顯著高于常氧安靜組、常氧運動組和低氧安靜組，低氧運動組蘋果酸脫氫酶（MDH）的活性也比常氧安靜組、常氧運動組和低氧安靜組高，但只與常氧安靜組和低氧安靜組有顯著性差異[7]。模擬3500 m海拔高度低氧訓(xùn)練6周，高住高練組大鼠腓腸肌檸檬酸合成酶（CS）、琥珀酸脫氫酶（SDH）和蘋果酸脫氫酶（MDH）活性顯著高于常氧訓(xùn)練組[8]。據(jù)此推斷，低氧訓(xùn)練在改善線粒體呼吸鏈功能方面較常氧訓(xùn)練更有效，其機制可能與低氧訓(xùn)練更有效地提高三羧酸循環(huán)酶的活性，使進入呼吸鏈的底物NADH及FADH2更加充足，通過底物調(diào)節(jié)機制促進呼吸鏈酶的活性，從而使呼吸鏈功能得到提高。本研究結(jié)果還得到本研究小組先前研究結(jié)果的支持，即模擬海拔3500 m低氧環(huán)境，高住高練組骨骼肌線粒體呼吸鏈CⅠ～Ⅱ活性顯著高于常氧訓(xùn)練組[9]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在提高呼吸鏈酶活性方面，與安靜對照組相比，常氧訓(xùn)練組CⅢ活性著性提高，2500 m低氧訓(xùn)練組CⅠ活性顯著提高，3500 m低氧訓(xùn)練組CⅠ和CⅢ活性均顯著提高，2500 m～3500 m交替低氧訓(xùn)練組CⅠ～CⅣ活性均顯著提高。由此可看出，在常氧環(huán)境下進行訓(xùn)練，骨骼肌線粒體呼吸鏈CⅢ最敏感，在2500 m低氧環(huán)境下進行訓(xùn)練，呼吸鏈起始酶CⅠ最敏感，在3500 m低氧環(huán)境下進行訓(xùn)練，呼吸鏈起始酶CⅠ和CⅢ最敏感，2500 m～3500 m交替環(huán)境下進行訓(xùn)練，CⅠ～CⅣ都比較敏感。這說明不同氧濃度復(fù)合運動訓(xùn)練對線粒體呼吸鏈不同部位酶活性的影響不同，其機制還有待進一步研究。

另外，由本研究結(jié)果還可看出，線粒體呼吸鏈CⅠ活性由高到低為：2500 m～3500 m HT組＞3500 m HT組＞2500 m HT組＞NT組＞C組，且常氧訓(xùn)練組高于安靜對照組，低氧訓(xùn)練組顯著高于安靜對照組，交替低氧訓(xùn)練組最高。CⅡ活性由高到低為：2500 m～3500 m HT組＞3500 m HT組＞2500 m HT組＞NT組＞C組，其活性也呈現(xiàn)常氧訓(xùn)練組和低氧訓(xùn)練組均高于安靜對照組，且交替低氧訓(xùn)練組顯著高于安靜對照組，交替低氧訓(xùn)練組最高。CⅢ活性由高到低為：NT組＞3500 m HT組＞2500 m～3500 m HT組＞2500m HT組＞C組，除2500 m HT組外，其余各組均顯著高于安靜對照組，且低氧訓(xùn)練組與常氧訓(xùn)練組之間無顯著性差異。CⅣ活性由高到低為：2500 m～3500 m HT組＞3500 m HT組＞2500 m HT組＞NT組＞C組，常氧訓(xùn)練組和低氧訓(xùn)練組均高于安靜對照組，且交替低氧訓(xùn)練組顯著高于安靜對照組，交替訓(xùn)練組最高。這說明，在提高骨骼肌線粒體呼吸鏈功能方面，交替低氧訓(xùn)練好于固定高度低氧訓(xùn)練和常氧訓(xùn)練。高-高交替訓(xùn)練比恒定海拔高度訓(xùn)練在改善呼吸鏈功能方面效果更佳，其機制可能與機體長時間在同一海拔訓(xùn)練可對該海拔缺氧刺激產(chǎn)生適應(yīng)，使得該海拔高度對機體缺氧刺激不敏感，而交替海拔缺氧增強了機體對缺氧的敏感性，從而將機體潛力最大程度的挖掘出來有關(guān)。因此，高-高交替低氧訓(xùn)練在改善骨骼肌線粒體呼吸鏈功能方面是一種較好的訓(xùn)練模式。另外，機體運輸氧的能力提高也有助于線粒體呼吸功能的提高。

4 結(jié)論

低氧訓(xùn)練在提高骨骼肌線粒體呼吸鏈功能方面較常氧訓(xùn)練更具優(yōu)勢，且交替低氧訓(xùn)練效果最佳。

[1]周潔.云南省高原地理環(huán)境與交叉訓(xùn)練[J].體育科學(xué)，2006，26（9）：63-67.

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Effects of Alternating Hypoxia Training at Different Altitudes on Mitochondrial Respiratory Function of Skeletal Muscles in Rats

Li Jie1，Liu Xifeng2
1 College of Physical Education，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China 2 College of Agricultural and Animal Husbandry，Tibet University，Nyingchi 860000，China Corresponding Author：Lijie，Email：lijie2005ty@126.com

ObjectiveTo explore the effects of alternating hypoxia training at different altitudes on mitochondrial respiratory function of skeletal muscles in rats.MethodsFifty healthy male Wistar rats were randomly divided into a normoxic control group（C），a normoxic training group（NT），a 2500 m hypoxia training group（2500 m HT），a 3500 m hypoxia training group（3500 m HT）and a 2500 m-3500 m alternating hypoxia training group（2500 m-3500 m HT），each of 10.Except group C，all the other groups received the incremental load treadmill training 6 days a week and lived in the attitudes their group name indicated for 4 weeks.The rats of all groups were killed as soon as the training ended，and the whole blood and skeletal muscle samples were taken immediately.Their mitochondria were extracted using the gradient centrifugation.The number of red blood cell（RBC），hemoglobin content（Hb）and the activity of skeletal muscle mitochondrial respiratory chain complex（CⅠ～Ⅳ）were measured.Results（1）The average numbers of RBC and Hb content increased significantly（P＜0.05，P＜0.01）in train-ing groups compared with group C，those of group NT were significantly lower than hypoxia training groups（P＜0.01）.Compared with 2500 m HT and 3500 m HT groups，those of the 2500 m～3500 m HT group increased significantly（P＜0.01）.（2）Compared with group C，the CⅢactivity of group NT，CⅠactivity in 2500 m HT group，CⅠand CⅢactivity of 3500 m HT group and CⅠ～Ⅳactivity of 2500 m～3500 m HT group increased significantly（P＜0.05，P＜0.01）.Compared with the NT group，the CⅠactivity of 3500 m HT group，CⅠand CⅡactivity of 2500 m～3500 m HT group were significantly increased（P＜0.01，P＜0.05）.Compared with the 2500 m HT group，the CⅡactivity of 2500 m～3500 m HT group was significantly increased（P＜0.05）.ConclusionThe hypoxia training has more advantages than normoxic training in improving skeletal muscle mitochondrial respiratory chain function，and the effect of alternating hypoxia training is the best.

alternating hypoxia training，skeletal muscle，mitochondria，respiratory chain，enzyme activity，blood

2016.05.26

李潔，Email：lijie2005ty@126.com