王瑞國(guó)　蘇曉鷗　王培龍　張維　薛巖　李玉

摘要建立了同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物血漿中黃曲霉毒素B1等21種霉菌毒素或其代謝物殘留的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法。動(dòng)物血漿樣品中加入0.1%甲酸乙腈溶液、NaCl和無水MgSO4進(jìn)行萃取，無水MgSO4和C18，PSA，AAL對(duì)提取液進(jìn)行脫水凈化，經(jīng)濃縮、復(fù)溶和離心后，再進(jìn)行測(cè)定。采用反相C18色譜柱分離，以0.1%甲酸0.5 mmol/L 乙酸銨溶液和0.1%甲酸甲醇溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用電噴霧離子源（ESI）多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子模式（MRM）進(jìn)行檢測(cè)，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，線性范圍在0.05～100 ng/mL之間，方法的定量限為0.05～0.5 ng/mL。在高、中、低3個(gè)添加濃度水平下，21種霉菌毒素的平均回收率為62.0%～116.4%， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于19%。

關(guān)鍵詞液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜； 動(dòng)物血漿； 霉菌毒素； 殘留

1引 言

霉菌毒素（Mycotoxins）是霉菌在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的次級(jí)有毒代謝產(chǎn)物[1]，目前已經(jīng)確認(rèn)化學(xué)結(jié)構(gòu)的霉菌毒素達(dá)400多種[2]，這些霉菌毒素主要由曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀菌屬（Fusarium）、青霉屬（Penicillium）、鏈格孢屬（Alternaria）和麥角菌屬（Claviceps）霉菌產(chǎn)生[3]。谷物、油料籽實(shí)以及由此加工的動(dòng)物飼料特別易于被各種霉菌毒素污染，從而造成人或動(dòng)物急性或慢性中毒反應(yīng)[4]。研究顯示，全球大約25%的農(nóng)產(chǎn)品受到霉菌毒素污染，因此需要對(duì)其進(jìn)行監(jiān)測(cè)以控制食物鏈中的霉菌毒素[5]。世界衛(wèi)生組織將霉菌毒素納入食品安全體系重點(diǎn)監(jiān)測(cè)內(nèi)容[6]，中國(guó)對(duì)食品和飼料中黃曲霉毒素等重要毒素規(guī)定了最高限量標(biāo)準(zhǔn)[7～11]。評(píng)價(jià)人和動(dòng)物霉菌毒素暴露水平一般采取分析食品、飼料中霉菌毒素含量的間接方法[12]。由于受到食品和飼料中霉菌毒素污染水平、加工方式、個(gè)體攝入和吸收代謝等多種因素影響，這種方法的評(píng)估結(jié)果可靠性比較差[13]。近年來，一些研究直接測(cè)定人和動(dòng)物血液、尿液等生物樣本中霉菌毒素或其代謝物， 反映霉菌毒素暴露水平及其體內(nèi)的吸收代謝過程。例如，urner等[14]調(diào)查了英國(guó)34名成年人尿液中嘔吐毒素及其葡萄糖醛苷酸結(jié)合物濃度范圍為5.0～78.2 ng/mL，證實(shí)了葡萄糖醛苷酸化是嘔吐毒素在人體內(nèi)主要代謝途徑。Cunha等[15]對(duì)13名葡萄牙志愿者尿液中嘔吐毒素進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)69%的志愿者尿液中檢出嘔吐毒素或其代謝物。Meky等[16]研究了小鼠恩鐮孢菌素A連續(xù)暴露28天，其在血液、尿液和糞便中殘留水平與暴露時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化。然而，這些方法只針對(duì)一種或一類結(jié)構(gòu)相似的霉菌毒素進(jìn)行檢測(cè)，但飼料由于原料來源復(fù)雜多樣，常被多種霉菌毒素污染[17]。因此，開發(fā)動(dòng)物血漿中多種霉菌毒素同時(shí)檢測(cè)方法具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，已經(jīng)有少量關(guān)于動(dòng)物和人血液等生物樣本中霉菌毒素檢測(cè)方法的報(bào)道。這些方法主要有高效液相色譜法[18]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[19～21]和氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[22]，樣品前處理方法采用了免疫親和柱[18，19]或固相萃取[20～22]等技術(shù)，操作比較繁瑣，檢測(cè)費(fèi)用高，一般難以做到多種霉菌毒素的同時(shí)測(cè)定。QuECERs方法（Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged， Safe）是近年發(fā)展起來的一種用于農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的快速樣品前處理技術(shù)，利用吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，吸附雜質(zhì)從而達(dá)到除雜凈化的目的。本研究應(yīng)用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，基于QuECERs原理開發(fā)了樣品提取和凈化方法，同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物血漿中21種霉菌毒素及其代謝物，具有操作簡(jiǎn)單、快速、成本低、定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)，可用于動(dòng)物霉菌毒素聯(lián)合暴露評(píng)估及霉菌毒素毒代動(dòng)力學(xué)研究。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Acquity超高效液相色譜儀、XEVO QS串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）； RVC 218臺(tái)式離心濃縮儀（德國(guó)CRIS公司）； 3K15高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）； D37520高速離心機(jī)（美國(guó)Kendro公司）； VXⅢ多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品及由標(biāo)準(zhǔn)品配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液（溶劑為乙腈）濃度信息見表1。乙腈、甲醇和甲酸（色譜純，美國(guó)Fisher公司）； 實(shí)驗(yàn)用水為MilliQ超純水。混合標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液于

2.2樣品前處理

準(zhǔn)確量取2.0 mL（精確至0.001 mL）豬血漿樣品于50 mL塑料離心管中，向其中加入6 mL 0.1%甲酸乙腈溶液以沉淀蛋白，2000 r/min渦旋1 min，置于4℃冷藏20 min，再加入0.2 g NaCl和0.8 g無水MgSO4，2000 r/min渦旋1 min，8000 r/min離心5 min。靜置片刻，量取上層溶液4 mL置于10 mL具塞塑料離心管中，加入無水MgSO4 600 mg， C18，PSA，AAL各100 mg， 2000 r/min渦旋1 min，10000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm尼龍微孔濾膜，精密量取濾液3 mL置于10 mL塑料離心管中，真空濃縮儀中60℃、1500 r/min抽干，用0.5 mL 0.1%甲酸乙腈（70∶30， V/V）溶解殘?jiān)?3000 r/min離心5 min，取上清液置于進(jìn)樣小瓶中，供LCMS/MS測(cè)定。

2.3色譜和質(zhì)譜條件

Acquity UPLC BERP18色譜柱（100 mm × 2.1mm，1.7 μm，美國(guó)Waters公司）； 柱溫40℃，流速0.3 mL/min， 進(jìn)樣量3 μL。流動(dòng)相A為0.1%甲酸0.5 mmol/L乙酸銨溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸甲醇。梯度洗脫： 0～2 min，95% A； 2～4 min，95%～80% A； 4～12 min，80%～5% A； 12～12.1 min，5%～1% A； 12.1～13 min，1% A； 13～13.5 min，1%～95% A； 13.5～14 min，95% A。

電噴霧離子源（ESI），離子源溫度為150℃，脫溶劑溫度為450℃，脫溶劑氣和錐孔氣均為N2，脫溶劑氣流速為1000 L/h，錐孔氣流速為40 L/h。序號(hào)1～16霉菌毒素采用正離子監(jiān)測(cè)，序號(hào)17～21霉菌毒素采用負(fù)離子監(jiān)測(cè)方式。采用MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式檢測(cè)，監(jiān)測(cè)離子、碰撞能量、錐孔電壓等參數(shù)見表2。

3結(jié)果與討論

3.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

以甲醇水（50∶50， V/V）為流動(dòng)相，采用結(jié)合（Combine）進(jìn)樣方式，對(duì)21種霉菌毒素的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描，選擇合適的準(zhǔn)分子離子峰和電離方式。根據(jù)不同化合物的響應(yīng)，設(shè)置不同的掃描模式。其中，正電離模式下獲得[M+]+或 [M+N4]+，負(fù)電離模式下獲得[M-]-。結(jié)合基質(zhì)空白和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液的離子掃描圖，進(jìn)一步優(yōu)化參數(shù)，確定了各種毒素在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下信號(hào)采集的特征離子對(duì)（表2）。對(duì)于具有相同保留時(shí)間的同分異構(gòu)體3AcDON和15AcDON，選擇各自特有的離子碎片作為監(jiān)測(cè)子離子。

3.2色譜條件優(yōu)化

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果[23]，采用0.1%甲酸和0.1%甲酸甲醇作為流動(dòng)相，梯度洗脫，分段采集目標(biāo)物峰信號(hào)，適用于多種霉菌毒素的同步檢測(cè)。由于部分目標(biāo)物母離子電離方式是+N4的方式，所以在流動(dòng)相0.1%甲酸中添加0.5 mmol/L乙酸銨，以獲得更好的峰響應(yīng)信號(hào)。本流動(dòng)相梯度設(shè)定對(duì)于具有相同離子碎片的同分異構(gòu)體αZEL、βZEL以及αZAL和βZAL能夠通過保留時(shí)間實(shí)現(xiàn)良好分離。圖1為空白豬血漿加標(biāo)的定量離子色譜圖。

3.3提取方法的優(yōu)化

選擇血漿樣品3倍體積的0.1%甲酸乙腈作為提取液，主要考慮到乙腈既能夠沉淀血漿中的蛋白，也是霉菌毒素目標(biāo)物的良好溶劑，在NaCl和無水MgSO4的鹽析作用下，待測(cè)霉菌毒素能夠很好地從血漿中進(jìn)入乙腈層，甲酸則有助于保持酸性提取和凈化體系。對(duì)提取方式考察表明，本實(shí)驗(yàn)的提取條件下，除黃曲霉毒素M1萃取率偏低外，其它待測(cè)目標(biāo)物的萃取率均超過80%。為避免在加入無水MgSO4時(shí)溶液發(fā)熱，提前將樣品置于4℃冷藏20 min。

3.4凈化材料的選擇

考察了C18， PSA， AAL和GCB對(duì)豬血漿樣品中目標(biāo)物的凈化回收效果。結(jié)果表明，GCB對(duì)大部分目標(biāo)物有強(qiáng)吸附作用，回收率<30%，C18， PSA和AAL對(duì)目標(biāo)物均無明顯吸附作用，回收率在80%～120%之間。C18可以吸附血漿中脂肪和脂類等非極性的組分，降低檢測(cè)過程中的雜質(zhì)干擾； PSA可以有效去除樣品中的有機(jī)酸和色素，而且對(duì)于大部分目標(biāo)物質(zhì)譜峰相應(yīng)信號(hào)具有明顯增強(qiáng)效果； AAL也有一定的脫脂效果，并能夠顯著降低AFB1， 2， DON和ZEA等目標(biāo)物的基質(zhì)干擾，提高檢測(cè)靈敏度。其次，應(yīng)用20個(gè)不同來源的豬、綿羊、奶牛等血漿樣品，進(jìn)一步考察了C18、PSA和AAL的適宜添加量。結(jié)果顯示，C18、PSA和AAL各100mg即可對(duì)4 mL樣品提取液進(jìn)行有效凈化。 此外，還發(fā)現(xiàn)由于樣品提取液中存在少量水會(huì)影響到樣品的濃縮過程，添加600 mg無水MgSO4可以有效去除待凈化提取液中殘存的水。

3.5基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

用0.1%甲酸乙腈（70∶30， V/V）配制系列梯度濃度（目標(biāo)物序號(hào)1～9為0.05， 0.1， 0.5， 1.0， 5.0和20.0 ng/mL； 目標(biāo)物序號(hào)10～21為0.25， 0.5， 2.5， 5.0， 25.0和100.0 ng/mL）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時(shí)量取豬血漿樣品，按照前處理步驟提取、

凈化和分析，確定不含痕量目標(biāo)物后，再用空白樣品進(jìn)樣液稀釋與溶劑標(biāo)樣濃度相同的系列基質(zhì)匹配標(biāo)樣，分別以標(biāo)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析。

基質(zhì)匹配與溶劑標(biāo)樣曲線斜率的比值（圖2）可反映出基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱，0.8～1.2可認(rèn)為是無基質(zhì)效應(yīng)，超過這一范圍則表明具有較強(qiáng)的基質(zhì)抑制或增強(qiáng)效應(yīng)。由圖2可見，AFB1等12種目標(biāo)物在0.8～1.2內(nèi)，而SE等9種目標(biāo)物則低于0.8。因此，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析。

3.6方法的線性范圍與定量限

用空白樣品提取液配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制濃度為0.05～20 ng/mL（目標(biāo)物序號(hào)為1～9）和0.25～100 ng/mL（目標(biāo)物序號(hào)為10～21），根據(jù)10倍信噪比（S/N）確定化合物的方法定量限（LOQ），以濃度為橫坐標(biāo)和定量離子對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸計(jì)算， 線性相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99，結(jié)果見表3。

3.7回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

采用豬血漿空白樣品，進(jìn)行添加回收和精密度實(shí)驗(yàn)。樣品中添加低、中、高3個(gè)濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加濃度設(shè)6個(gè)平行樣本，按本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行樣品處理和測(cè)定， 結(jié)果見表4，平均回收率為62.0%～116.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.9%～19.0%。

3.8實(shí)際樣品分析

應(yīng)用本方法對(duì)分別經(jīng)靜脈同時(shí)注射AFB1、DON和ZEA低、高兩種劑量（低濃度： 5， 15和15 μg/kg BW； 高濃度： 10， 30和30 μg/kg BW）2 h后的綿羊血漿樣品進(jìn)行測(cè)定，低劑量組檢出AFB1、DON、ZEA藥物原型及代謝物AFM1、αZEL和βZEL的濃度分別為1.75， 0.25， ND， 0.28， 0.55和0.51 ng/mL； 高劑量組檢出濃度分別為6.24， 2.72， 1.15， 1.58， 1.31和1.15 ng/mL，血漿中霉菌毒素及其代謝物濃度與給藥劑量呈正相關(guān)。結(jié)果表明，本方法能夠?qū)?dòng)物血漿樣品中多種霉菌毒素同時(shí)進(jìn)行快速、靈敏的檢測(cè)，適用于動(dòng)物霉菌毒素暴露的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和毒代動(dòng)力學(xué)等研究。

AbstractA novel method for simultaneous detection of mycotoxins （e.g.， aflatoxin B1） or their metabolic residues in animal plasma with impurity adsorption purification followed ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （UPLCMS/MS） was developed. Extraction of mycotoxins and their metabolites from animal plasma sample was performed with 0.1% formic acidacetonitrile solution after addition of sodium chloride and hydrous magnesium sulfate. he extract was then dehydrated and purified with hydrous magnesium sulfate， C18， primary secondary amine， and aluminaA. 3 mL of the supernatant was evaporated and redissolved with 0.5 mL of 0.1% formic acid aqueous solution/acetonitrile （70∶30， V/V） for UPLCMS/MS detection. he analytes were separated by a C18 column utilizing gradient elution with 0.1% formic acid aqueous solution containing 0.5 mmol of ammonium acetate and 0.1% formic acidmethanol solution， and finally detected by tandem mass spectrometry in positive/negative ESI mode. Identification and quantification were achieved by LCMS/MS with multireaction monitoring （MRM）. Good linearity in response was obtained in the analytes concentration range of 0.05-100 ng/mL with correlation coefficients larger than 0.99. he limits of quantification （S/N=10） were around 0.05-0.5 ng/mL. he recoveries of mycotoxins and their metabolites spiked in blank plasma samples were in the range of 62.0%-116.4%， with relative standard deviations （RSDs） less than 19.0%.

KeywordsLiquid chromatographytandem mass spectrometry； Plasma； Mycotoxins； Residue