焦 陽(yáng)，汪 冰，林永強(qiáng)，徐麗華（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，濟(jì)南 250101）

阿膠三寶膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究Δ

焦 陽(yáng)＊，汪 冰，林永強(qiáng)，徐麗華（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，濟(jì)南 250101）

目的：提高阿膠三寶膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC-MS）鑒別制劑中的阿膠：色譜柱為Acquity UPLC BEH-C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸溶液（梯度洗脫），流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣量為5μL，離子源為電噴霧離子源，毛細(xì)管電壓為3.5 kV，毛細(xì)管出口電壓為120 V，錐孔電壓為50 V，脫溶劑溫度為400℃，干燥氣流速為10 L/min，霧化器壓為40 psi，碰撞能量為10～45 V，掃描范圍m/z 200～1 500，檢測(cè)方式為正離子模式（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；采用高效液相色譜法測(cè)定制劑中4種水解氨基酸的含量：色譜柱為Agela Venusil XBP-C18，流動(dòng)相A為乙腈-0.1 mol/L乙酸鈉溶液（36%乙酸調(diào)pH至6.5）（7∶93，V/V），流動(dòng)相B為80%乙腈溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為43℃。結(jié)果：阿膠的UPLC-MS圖峰形清晰，專(zhuān)屬性強(qiáng)，陰性無(wú)干擾。L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為0.081 9～0.655 2 μg（r＝0.999 9）、0.186 2～1.489 6 μg（r＝0.999 8）、0.070 3～0.562 0 μg（r＝0.999 9）、0.124 2～0.993 6 μg（r＝0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為99.85%～103.69%（RSD＝1.35%，n＝6）、99.91%～103.93%（RSD＝1.46%，n＝6）、96.86%～101.27%（RSD＝1.69%，n＝6）、97.44%～101.45%（RSD＝1.54%，n＝6）。結(jié)論：提高的標(biāo)準(zhǔn)能更加有效地控制阿膠三寶膏的質(zhì)量。

阿膠三寶膏由阿膠、大棗和黃芪3味中藥組合而成，具有補(bǔ)氣血、健脾胃之功效，常用于氣血兩虧、脾胃虛弱所致的心悸、氣短、崩漏、浮腫、食少等癥的治療[1]。其最早載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第二冊(cè)）》[2]，但僅收載了性狀和常規(guī)檢查項(xiàng)。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為2015年版《中國(guó)藥典》（一部），增加了采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定黃芪甲苷含量和總氮量項(xiàng)目。本試驗(yàn)對(duì)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行完善，增加了制劑中君藥阿膠的特征鑒別[3]，并將原標(biāo)準(zhǔn)中總氮量的測(cè)定修訂為阿膠中4種水解氨基酸的HPLC定量測(cè)定[4]。

1 材料

1.1 儀器

Quattro Premier XE型超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS）儀、LC-20A型HPLC儀（包括LC-20AT四元泵、SPD-20A紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器、DGU-20A5自動(dòng)脫氣裝置、SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20AC柱溫箱）均購(gòu)自美國(guó)Waters公司；CP225D型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：500 W，頻率：40 kHz）。

1.2 藥品與試劑

阿膠三寶膏（山東東阿阿膠股份有限公司，批號(hào)：120701、1211001、1301001，規(guī)格：250 g/瓶）；L-羥脯氨酸對(duì)照品（批號(hào)：111578-200201，純度：100%）、甘氨酸對(duì)照品（批號(hào)：140689-201103，純度：99.9%）、丙氨酸對(duì)照品（批號(hào)：140680-201303，純度：99.9%）、L-脯氨酸對(duì)照品（批號(hào)：140677-201206，純度：100%）、阿膠對(duì)照藥材（批號(hào)：121274-201202）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；胰蛋白酶（美國(guó)Promega公司，批號(hào)：ADV5280000 01120296）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 阿膠的鑒別

2.1.1 試驗(yàn)條件 （1）色譜條件。色譜柱：Acquity UPLC BEH-C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～25 min，5%→20%A；25～40 min，20%→50%A）；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5μL。（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；毛細(xì)管出口電壓：120 V；錐孔電壓：50 V；脫溶劑溫度：400℃；干燥氣流速：10 L/min；霧化器壓：40 psi；碰撞能量：10～45 V；掃描范圍：m/z 200～1 500；檢測(cè)方式：正離子模式（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。

2.1.2 對(duì)照藥材溶液的制備 取阿膠對(duì)照藥材0.1 g，加1%碳酸氫銨溶液50 mL，超聲處理30 min，微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液100μL，置于微量進(jìn)樣瓶中，加胰蛋白酶溶液（胰蛋白酶100μg溶于1%碳酸氫銨溶液100μL中，下同）10μL，搖勻，37℃恒溫酶解12 h，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取樣品1.0 g，加1%碳酸氫銨溶液50 mL，超聲處理30 min，微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液100μL，置于微量進(jìn)樣瓶中，加胰蛋白酶溶液10μL，搖勻，37℃恒溫酶解12 h，即得。

2.1.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按阿膠三寶膏處方和制備工藝制備缺阿膠的陰性樣品，并按“2.1.3”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.1.5 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取“2.1.2”“2.1.3”“2.1.4”項(xiàng)下對(duì)照藥材溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，陰性對(duì)照在相應(yīng)位置未見(jiàn)干擾峰，方法專(zhuān)屬性良好。

圖1 對(duì)照藥材、供試品、陰性對(duì)照的超高效液相色譜-質(zhì)譜圖Fig 1 UPLC-MS chromatograms of reference medicinal herbs，test samples and negative control

2.1.6 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照藥材溶液適量，按“2.1.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，m/z 539.8→612.4提取離子流峰與m/z 539.8→923.8提取離子流峰峰面積的RSD分別為4.32%、4.18%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 樣品鑒別 取3批樣品各適量，分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，鑒別其成分，詳見(jiàn)圖2。結(jié)果，3批樣品的UPLCMS出峰時(shí)間一致。

2.2 4種水解氨基酸的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agela Venusil XBP-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：乙腈-0.1 mol/L乙酸鈉溶液（36%乙酸調(diào)pH至6.5）（7∶93，V/V），流動(dòng)相B：80%乙腈溶液，梯度洗脫（0～20 min，100%→93%A；20～23.9 min，93%→88%A；23.9～24 min，88%→85%A； 24～39 min，85%→66%A；39～40 min，66%→0A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：43℃。

圖2 樣品的超高效液相色譜-質(zhì)譜圖Fig 2 UPLC-MS chromatograms of samples

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取待測(cè)水解氨基酸對(duì)照品適量，加0.1 mol/L鹽酸溶液制成L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸質(zhì)量濃度分別為0.081 9、0.186 2、0.070 3、0.124 2 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取樣品約2.5 g，精密稱定，加0.1 mol/L鹽酸溶液20 mL，超聲處理30 min，放冷，加0.1 mol/L鹽酸溶液定容至25 mL，搖勻。精密量取上述溶液2 mL，置于10 mL安瓿中，加2 mL鹽酸，熔封，置于150℃恒溫箱中1 h，放冷，移至蒸發(fā)皿中，用水10 mL分次洗滌，洗液并入蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)?.1 mol/L鹽酸溶液溶解并定容至25 mL，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.2.4 混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液的衍生化溶液的制備 分別精密量取“2.2.2”“2.2.3”“2.1.4”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各5 mL，加1 mol/L異硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液2.5 mL，然后再加1 mol/L三乙胺乙腈溶液2.5 mL，搖勻，室溫放置1 h，加50%乙腈定容至25 mL，搖勻。量取上述溶液10 mL，置于分液漏斗中，加正己烷10 mL，振搖后靜置分層，取下層溶液，濾過(guò)，即得。

2.2.5 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取“2.2.4”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液的衍生化溶液各適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，陰性對(duì)照在相應(yīng)位置未見(jiàn)干擾峰，方法專(zhuān)屬性良好。

圖3 高效液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms

2.2.6 線性關(guān)系考察 取待測(cè)水解氨基酸對(duì)照品適量，加0.1 mol/L鹽酸溶液制成L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸質(zhì)量濃度分別為0.081 9、0.186 2、0.070 3、0.124 2 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。分別精密量取上述混合對(duì)照品溶液1、2、4、6、8 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)水解氨基酸進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸回歸方程，分別為y＝1 356 820.6x—254.3（r＝0.999 9）、y＝2 065 568.1x—7 326.1（r＝0.999 8）、y＝1 675 750.1x—1 011.6（r＝0.999 9）、y＝1 561 586.887 8x+65.615 9（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為0.081 9～0.655 2、0.186 2～1.489 6、0.070 3～0.562 0、0.124 2～0.993 6 μg。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取“2.2.4”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液的衍生化溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸峰面積的RSD分別為0.35%、0.38%、0.37%和0.52%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.4”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：1301001）的衍生化溶液適量，分別于室溫下放置0、5、10、15、20、25 h時(shí)按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸峰面積的RSD分別為1.27%、1.25%、1.48%和1.18%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置25 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品（批號(hào)：1301001）適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液的衍生化溶液，共6份，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果，L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸平均含量分別為 8.33、16.37、6.96、13.89 mg/g，RSD分別為1.61%、1.94%、1.19%、1.69%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量樣品（批號(hào)：1301001）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的待測(cè)水解氨基酸對(duì)照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，另按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液的衍生化溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.2.11 樣品含量測(cè)定 取3批樣品各適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，另按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液的衍生化溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)合阿膠三寶膏中阿膠的處方量和制成總量計(jì)算4種水解氨基酸的理論含量分別為7.2、16.2、6.3和9.0 mg/g。考慮水分、制劑工藝等影響因素，并結(jié)合實(shí)際測(cè)定結(jié)果，暫定限度為每1 g含阿膠以L-羥脯氨酸計(jì)，不得少于6.1 mg；以甘氨酸計(jì)，不得少于13.8 mg；以丙氨酸計(jì)，不得少于5.4 mg；以L-脯氨酸計(jì)，不得少于7.7 mg。

3 討論

阿膠是馬科動(dòng)物驢Equus asinus L.的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠，是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥，具有滋陰補(bǔ)血、潤(rùn)燥、止血之效。處方中含有阿膠的中藥制劑品種繁多，但由于現(xiàn)行方法對(duì)制劑中阿膠的質(zhì)量控制缺乏針對(duì)性，專(zhuān)屬性較差。不法廠家用其他劣質(zhì)皮類(lèi)替代驢皮熬制阿膠的違法行為時(shí)有發(fā)生，導(dǎo)致此類(lèi)制劑質(zhì)量良莠不齊，藥效無(wú)法得到保障。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of contents determination of samples（n＝3）

本試驗(yàn)采用UPLC-MS法，建立了阿膠特征肽的專(zhuān)屬性鑒別，結(jié)果表明，本鑒別方法高效、快速、專(zhuān)屬性強(qiáng)，耐用性強(qiáng)，可有效地對(duì)阿膠三寶膏中的阿膠進(jìn)行鑒別。

本試驗(yàn)參照2015年版《中國(guó)藥典》（一部）阿膠項(xiàng)下含量測(cè)定的方法，建立了阿膠三寶膏中阿膠4種水解氨基酸的HPLC含量測(cè)定項(xiàng)。由于制劑處方中還含有大棗和黃芪，水溶性雜質(zhì)較多，因此筆者根據(jù)制劑的實(shí)際情況優(yōu)化液相條件，延長(zhǎng)洗脫時(shí)間，以獲得更好的分離度。按優(yōu)化后的色譜方法進(jìn)行試驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性和回收率均良好。

綜上所述，提高的標(biāo)準(zhǔn)能更加有效地控制阿膠三寶膏的質(zhì)量。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：1010.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑：第二冊(cè)[S].WS3-B-0297-90.

[3] 程顯隆.膠類(lèi)藥材質(zhì)量控制關(guān)鍵技術(shù)研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2014.

[4] 陳再潔，殷金龍，李坤，等.柱前衍生RP-HPLC法測(cè)定人參中17種氨基酸的含量[J].中國(guó)藥房，2012，23（35）：3334-3337.

Study on the Improvement of Quality Standard for Ejiao Sanbao Cream

JIAO Yang，WANG Bing，LIN Yongqiang，XU Lihua（Shandong Institute for Food and Drug Control，Jinan 250101，China）

OBJECTIVE：To improve the quality standard of Ejiao sanbao cream.METHODS：UPLC-MS was adopted to identify the donkey-hide glue in the preparation，the chromatographic conditions：column was Acquity UPLC BEH-C18with mobile phase of acetonitrile-0.1%formic acid（gradient elution），volumetric flow rate was 0.3 mL/min，injection volume was 5 μL，ion source is electrospray ionization source，capillary voltage was 3.5 kV，capillary outlet voltage was 120 V，cone voltage was 50 V，desolvation temperature was 400℃，drying gas flow was 10 L/min，nebulizer pressure was 40 psi，collision energy was 10-45 V，scan range was m/z 200-1 500；detection mode was positive ion mode（ESI+），multiple reaction monitoring.HPLC was used to determine the contents of 4 hydrohyzing amino acid：column was Agela Venusil XBP-C18with mobile phase A of acetonitrile-0.1 mol/ L sodium acetate solution（36%acetic acid adjusted to pH 6.5）（7∶93，V/V）and B of 80%acetonitrile solution（gradient elution）at a flow rate of 1.0 mL/min，the detection wavelength was 254 nm，and column temperature was 43℃.RESULTS：The UPLC-MS peak of Equus asinus was clear and specific，without negative interference.The linear range was 0.081 9-0.655 2 μg for L-hydroxyproline（r＝0.999 9），0.186 2-1.489 6 μg for glycine（r＝0.999 8），0.070 3-0.562 0 μg for alanine（r＝0.999 9）and 0.124 2-0.993 6 μg for L-proline（r＝0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 99.85%-103.69%（RSD＝1.35%，n＝6），99.91%-103.93%（RSD＝1.46%，n＝6），96.86%-101.27%（RSD＝1.69%，n＝6）and 97.44%-101.45%（RSD＝1.54%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The improved standard can more effectively control the quality of Ejiao sanbao cream.

Ejiao sanbao cream；Quality standard；UPLC-MS；HPLC

R927.2

A

1001-0408（2017）03-0376-05

2016-02-09

2016-04-25）

（編輯：張 靜）

國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)課題（No.2014ZX09304307-002-002）；山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.ZR2013HM074）

＊藥師。研究方向：藥物分析。電話：0531-81216522。E-mail：jiaoyang579@hotmail.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.03.25

關(guān)鍵詞阿膠三寶膏；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法；高效液相色譜法