陳艷艷，楊 威，李愛朋，侯璐璐，盧伯洋，董 宇

(吉林大學第一醫(yī)院 眼二科，吉林 長春130021)

*通訊作者

高糖條件下鋅對視網(wǎng)膜Müller細胞分泌VEGF的影響

陳艷艷，楊 威，李愛朋，侯璐璐，盧伯洋，董 宇*

(吉林大學第一醫(yī)院 眼二科，吉林 長春130021)

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病常見且嚴重的微血管并發(fā)癥之一，糖尿病患者視網(wǎng)膜缺血缺氧，導致血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)代償性增加，促進了視網(wǎng)膜新生血管的形成。Müller細胞是視網(wǎng)膜分泌VEGF的主要細胞，在糖尿病患者早期即會產(chǎn)生一系列病理生理的改變，從而導致VEGF的表達增加,在DR的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。鋅本身在抗氧化和抑制糖尿病所致的視網(wǎng)膜損傷上具有多方面生理作用，而糖尿病患者血清鋅水平與血糖呈顯著負相關(guān)，本實驗擬通過體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜Müller細胞，觀察補鋅能否抑制體外培養(yǎng)的Müller細胞VEGF表達的增加。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DAB顯色劑(武漢博士德公司)、H-DMEM培養(yǎng)基(Gibco BRL Co.)、標準胎牛血清(蘭州民海公司 )、兔抗鼠VEGF 多克隆抗體(武漢博士德公司)、免疫組織化學SP試劑盒(武漢博士德公司)、 TritonX-10(Promega 公司)、胰蛋白酶 (Hylclone Co)。

1.2 Müller 細胞的原代及傳代培養(yǎng)

將出生后3-5天大乳鼠(雌雄不限)(吉林大學動物中心提供)，用75%酒精浸泡麻醉后，無菌操作取出眼球，PBS液沖洗3遍，沿角膜緣旁約1 mm處環(huán)行剖開眼球，去除晶狀體和玻璃體，留后半眼球壁置于DMEM培養(yǎng)液中輕輕剝離視網(wǎng)膜，去除富含血管及髓放線后將視網(wǎng)膜剪碎成約1 mm×1 mm小片組織。吸取組織塊置于培養(yǎng)瓶中，加足量含20%標準胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于5%CO2，37℃恒溫孵箱內(nèi)培養(yǎng)。約7天后，細胞從組織塊周邊爬出并達到80%以上融合，此時進行消化傳代：將培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液吸出，加入0.1 mol/L PBS輕輕沖洗殘余培養(yǎng)液2次，小心吸出后加入2 ml 0.25%胰蛋白酶37℃下消化，顯微鏡下觀察，當細胞周邊剛剛回縮即停止，加入等量含血清的DMEM培養(yǎng)液，用吸管吹打后吸入離心管中離心800 r/min×5 min，棄上清液，加入培養(yǎng)液重懸沉淀，1∶2-1∶3移入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，第2代細胞供實驗用。

1.3 Müller細胞的鑒定

視網(wǎng)膜Müller 細胞的免疫組化染色按試劑盒說明書操作。結(jié)果判定：以在細胞的胞膜、胞漿或胞核部位出現(xiàn)棕黃色顆粒者判定為陽性，陽性細胞在蓋片上分布須均勻一致。

1.4 實驗分組

將2代培養(yǎng)細胞分為4組。正常組(N)：5 mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)液；高糖組(G)：25 mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)液；正常加鋅組(N+Z)：本組僅加5.0 μmol/L ZnSO4。高糖加鋅組(G+Z)： 分別加入2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、7.5 μmol/L、10 μmol/L ZnSO4。各組加入條件液后繼續(xù)培養(yǎng)6天。

1.5 結(jié)果判定

采用Imagepro-Plus軟件進行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用計算機圖像處理技術(shù)測定染色細胞累積光密度(IOD)。每張片子取五個視野，每個視野選定10個左右細胞測定灰度值。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

高糖組前5天Müller細胞VEGF水平高于高糖加鋅組,到第6天高糖組Müller細胞VEGF水平接近甚至低于高糖加鋅組;高糖組與正常組相比,前5天Müller細胞VEGF水平顯著升高,第6天基本降至正常,Müller細胞VEGF表達在第四天達高峰,高糖組與高糖加鋅組比較，Müller細胞VEGF水平顯著增高,并具有顯著性差異(P<0.01),高糖組與正常組比較Müller細胞VEGF表達水平顯著增高,具有顯著性差異(P<0.01);正常加鋅組、正常組與高糖加鋅組比較Müller細胞VEGF表達水平均無統(tǒng)計學差異(P<0.05)(表1)。

表1 各組Müller細胞VEGF表達灰度值結(jié)果

與正常組比較，*P<0.01，與高糖組比較，△P<0.01

3 討論

糖尿病是一個糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)的發(fā)生是由于糖尿病所造成的缺血缺氧的體內(nèi)環(huán)境，致使氧化應(yīng)激增加，氧自由基增多，氧化產(chǎn)物堆積，損傷了視網(wǎng)膜組織，造成微血管病變并導致血管閉塞，進而導致促血管生成因子和抑制因子的失衡，造成新生血管的形成.而新生血管生成因子中以VEGF研究頻率最高，VEGF能特異作用于視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞，可能是最直接的眼內(nèi)新生血管形成因子。正常條件下表達 VEGF 的細胞有多種細胞，包括神經(jīng)節(jié)細胞、Müller細胞、周細胞和視網(wǎng)膜色素上皮細胞等，糖尿病時Müller 細胞VEGF分泌增加，在DR發(fā)生發(fā)展中起至關(guān)重要的作用[1]，本實驗便是從Müller細胞著手，尋找抑制Müller細胞分泌VEGF的有效途徑和方法。

本實驗中采用25 mmol/L的高糖濃度體外培養(yǎng)Müller細胞，可以模擬糖尿病時體內(nèi)高血糖狀態(tài)[2]，正常條件下各時相Müller細胞VEGF的表達一直處于低且平穩(wěn)的水平，上下起伏波動不明顯，而高糖條件下1天、2天、3天、4天Müller細胞VEGF明顯隨著時間延長表達顯著增加，第5天開始下降，但仍明顯高于正常對照組，第6天降至接近甚至低于正常水平，說明了正常條件下視網(wǎng)膜Müller細胞VEGF穩(wěn)定低表達，而高糖條件可以誘導Müller細胞VEGF的表達增加，且第1到第4天表現(xiàn)出明顯的時間依賴性，隨時間延長表達亦顯著增加，直到第5天、第6天細胞出現(xiàn)形態(tài)改變，功能下降，部分細胞失去表達VEGF的功能，導致VEGF逐漸下降到等同甚或低于正常條件組細胞VEGF表達量，此時的細胞狀態(tài)已經(jīng)衰老達不到正常細胞的狀態(tài)，在本實驗中，高糖組及高糖加鋅組至第6天時VEGF表達反而下降，可能與此有關(guān)。實驗中發(fā)現(xiàn)在高糖條件下，隨時間延長，VEGF表達增加的現(xiàn)象，與臨床上我們看到的隨糖尿病病程越長，發(fā)生DR的可能性亦逐漸增加相一致。

目前國外大量體內(nèi)、外研究均證實，鋅在1型和2型糖尿病發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，在T2D患者，隨著血清鋅水平的下降，糖尿病微血管并發(fā)癥發(fā)病率的增加，補鋅可以改善血糖控制、降低糖尿病微血管病的發(fā)生率[3-6]。Moustafa研究表明鋅可以防止糖尿病大鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激過程并控制高血糖[7]。但是鋅缺乏作為糖尿病微血管并發(fā)癥的病因的證據(jù)還有待于更多的臨床研究證實[8]。本實驗通過體外高糖條件下培養(yǎng)的Müller細胞加鋅，研究補鋅對高糖情況下Müller細胞VEGF表達的影響，我們發(fā)現(xiàn)加鋅對高糖條件下培養(yǎng)的Müller細胞VEGF表達有明顯抑制作用，與國外研究結(jié)果相一致。高糖加鋅組同正常組及正常加鋅組比較無差異性(P>0.05)，而高糖加鋅組和高糖組細胞比較其VEGF表達水平具有顯著性差異(P<0.01)，說明鋅對高糖條件下Müller細胞VEGF的分泌具有抑制效應(yīng)，試驗中我們發(fā)現(xiàn)高糖加鋅組中5.0 μmol/L鋅濃度下與正常條件下各時相Müller細胞VEGF的表達曲線變化相接近，但因該研究尚處于體外培養(yǎng)細胞研究階段，是否為或接近為臨床最佳治療濃度，仍需大量研究證實，故適用于人類的最佳治療鋅濃度也可能成為未來研究熱點。

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1007-4287(2017)02-0307-03

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