朱建鋒，郭瑋，潘柏申

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032)

·專題筆談·

抗體介導(dǎo)的假性血小板減少及其解決方法*

朱建鋒，郭瑋，潘柏申

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032)

假性血小板減少(PTCP)是指血液分析儀計(jì)數(shù)得到的血小板結(jié)果明顯低于血小板真實(shí)值。盡管存在多種原因可導(dǎo)致PTCP，但臨床上主要用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，故PTCP以乙二胺四乙酸(EDTA)引起的血小板假性減少(EDTA-PTCP)為主。鑒別EDTA-PTCP快速、直觀的方法是制作血涂片并通過顯微鏡觀察血小板，一旦發(fā)現(xiàn)血小板聚集現(xiàn)象，則用其他方法計(jì)數(shù)血小板以避免誤診和其他不必要的檢查、治療及相關(guān)費(fèi)用。

假性血小板減少；抗凝劑；解決方法

假性血小板減少(pseudothrombocytopenia，PTCP)是指抗凝血液中血小板聚集，導(dǎo)致血液分析儀無法識(shí)別血小板，引起血小板計(jì)數(shù)結(jié)果明顯低于血小板真實(shí)值。這種情況在臨床易被誤診為免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)，進(jìn)而引起不必要的檢查、治療及相關(guān)費(fèi)用。

引起PTCP的原因主要有以下3種：(1)抗體介導(dǎo)的血小板聚集，最常見原因是抗凝劑乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)引起的假性血小板減少(EDTA-dependent pseudothrombocytopenia，EDTA-PTCP)和血小板衛(wèi)星現(xiàn)象；(2)未正確采集血標(biāo)本或抗凝劑未充分混勻而致血小板活化引起血小板聚集；(3)其他一些巨大血小板引起血小板計(jì)數(shù)假性減低。本文主要討論抗體介導(dǎo)的PTCP。

1 抗體介導(dǎo)的PTCP的主要類型

1.1EDTA-PTCP 1951年，Proesche記載了EDTA作為一種抗凝劑可用于血液檢測，但直到1969年Gowland等[1]報(bào)道了2例EDTA-PTCP。EDTA-PTCP機(jī)制較復(fù)雜、尚不完全明確，主要是在體外受到免疫(血小板抗體)、化學(xué)(抗凝劑)和物理(溫度)等因素共同作用引起血小板假性減少現(xiàn)象。門診EDTA-PTCP發(fā)生率約0.09%～0.11%[2]，住院患者約1.9%[3]。抗凝劑EDTA螯合鈣離子引起血小板膜蛋白構(gòu)象改變，暴露抗原決定簇，與體內(nèi)一些自身抗體結(jié)合。這些抗體多數(shù)是4～20 ℃時(shí)反應(yīng)活性最強(qiáng)的冷抗體，IgM出現(xiàn)頻率較IgG高，而IgA極少；而約20%在22 ℃與37 ℃時(shí)反應(yīng)也較活躍，幾乎均為IgM型抗體。將患者血漿或血清與健康人EDTA抗凝血混合后能重現(xiàn)血小板聚集現(xiàn)象，提示抗體直接作用的抗原廣泛存在[4]。

1.2枸櫞酸鹽引起PTCP 發(fā)生EDTA-PTCP時(shí)，枸櫞酸鹽常作為替代抗凝劑用于糾正EDTA引起的血小板聚集。但有10%～20%標(biāo)本改用枸櫞酸鹽抗凝檢測后仍然存在血小板聚集，不能糾正EDTA-PTCP。因?yàn)殍蹤此猁}螯合鈣離子，與體內(nèi)的一些自身抗體結(jié)合，發(fā)生血小板聚集現(xiàn)象。這些抗體多為IgM型，可能與37 ℃時(shí)EDTA抗凝劑誘導(dǎo)的PTCP為同一種抗體類型[2]。

1.3其他抗凝劑引起PTCP 文獻(xiàn)報(bào)道有許多替代的螯合或非螯合作用的抗凝劑[5-12]，如肝素鈉、草酸銨、氟化鈉、β-羥乙基茶堿、枸櫞酸鈉-5-磷酸吡哆醛-Tris緩沖液(citrate-pyridoxalphosphate-Tris，CPT)、枸櫞酸-枸櫞酸鈉-葡萄糖(acid-citrate-dextrose,ACD)、枸櫞酸鈉-茶堿-腺苷-潘生丁(citrate-theophylline-adenosine-dipyridamole,CTAD)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid,EGTA)、疊氮化鉀、氯化鈣/肝素鈣等。盡管這些抗凝劑常作為一種替代抗凝劑，但實(shí)際上很多抗凝劑會(huì)引起PTCP，故不能完全適用于常規(guī)血液檢查。CPT被證實(shí)能有效防止血小板聚集，同時(shí)能獲得準(zhǔn)確的血細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，有望取代EDTA，但需要校正紅細(xì)胞壓積與體積，且檢測成本較EDTA高，尚未推廣使用[13]。德國的一項(xiàng)研究顯示，以硫酸鎂為抗凝劑的商品化采血管可用于糾正PTCP，同時(shí)不影響紅細(xì)胞、白細(xì)胞及白細(xì)胞分類等結(jié)果[14]。

1.4血小板衛(wèi)星現(xiàn)象導(dǎo)致PTCP 1963年，F(xiàn)ield和MacLeod最早記載了一位14歲少年的抗凝外周血涂片中發(fā)現(xiàn)5～10個(gè)血小板圍繞于中性分葉核粒細(xì)胞外圍，偶見20個(gè)以上血小板；而單核、淋巴細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象[15]。隨后陸續(xù)有少量報(bào)道[16-17]，主要見于體外EDTA抗凝標(biāo)本中，以血小板聚集在多形核細(xì)胞(polymorphonuclear，PMN)周圍的形態(tài)特征而得名[18]。也有單核與淋巴細(xì)胞衛(wèi)星現(xiàn)象報(bào)道[19-20]。它是一種自身抗體引起的免疫反應(yīng)現(xiàn)象，只是不同于血小板聚集抗體類型，為37 ℃無活性的IgG?？贵w作為連接血小板和PMN之間的橋梁，將靶抗原血小板GPⅡb/GPⅢa和中性粒細(xì)胞FcγRⅢ受體連接起來，形成血小板圍繞在分葉核細(xì)胞表面的現(xiàn)象。血小板衛(wèi)星現(xiàn)象導(dǎo)致的血小板假性減低程度沒有EDTA-PTCP嚴(yán)重，對儀器血小板計(jì)數(shù)結(jié)果的影響相對較小。也正因?yàn)槿绱?，某種程度上可能低估了血小板衛(wèi)星現(xiàn)象的發(fā)生率。

1.5藥物治療引起PTCP 一些單抗藥物治療后可發(fā)生PTCP，經(jīng)皮冠脈造影患者為預(yù)防血栓形成，服用阿昔單抗時(shí)會(huì)出現(xiàn)PTCP，發(fā)生率為2.1%。對于此類患者必須明確真性或假性血小板減少，若為真性血小板減少，則必須停藥，同時(shí)需輸注單采血小板；而PTCP則可繼續(xù)抗凝治療。文獻(xiàn)報(bào)道1例ITP患者接受TPO(thrombopoietin，TPO)受體激動(dòng)劑藥物羅米司亭治療后，出現(xiàn)血小板聚集現(xiàn)象，導(dǎo)致血小板假性減低發(fā)生[21]；此時(shí)需明確是否為EDTA-PTCP，避免錯(cuò)誤評估藥物療效。

2 抗體介導(dǎo)的PTCP的發(fā)生機(jī)制

EDTA-PTCP產(chǎn)生的確切機(jī)制尚不完全清楚，但通常認(rèn)為是一種免疫機(jī)制介導(dǎo)的現(xiàn)象，發(fā)生在體外血液中，EDTA依賴性血小板自身抗體誘導(dǎo)血小板聚集。Pegels等[22]發(fā)現(xiàn)一種血小板無力癥，即Glanzmann病(Glycoprotein GPⅡb/GPⅢa缺失，血小板膜糖蛋白GPⅡb/GPⅢa缺失)，無此現(xiàn)象發(fā)生，從而推測抗體作用位點(diǎn)是GPⅡb/GPⅢa。研究發(fā)現(xiàn)EDTA-PTCP的自身抗體主要作用于血小板GPⅡb[23]。GPⅡb是一種Ca2+依賴蛋白質(zhì)，Ca2+存在時(shí)其與GPⅢa組成異源二聚體。當(dāng)Ca2+濃度降低時(shí)，GPⅡb/GPⅢa二聚體解離，顯露出GPⅡb上的隱性表位，而一些自身抗體正是作用于這一隱性表位，從而引起血小板聚集。因此，該現(xiàn)象是EDTA抗凝劑對鈣離子的螯合效應(yīng)所致，并非EDTA本身引起，所以具有螯合作用的枸櫞酸鈉等抗凝劑一定程度上均會(huì)引起血小板假性降低。

血小板衛(wèi)星現(xiàn)象導(dǎo)致PTCP發(fā)生的機(jī)制可能為體內(nèi)一些自身抗體可作為橋梁連接血小板和PMN，由于PMN細(xì)胞表面的是FcγRⅢb結(jié)構(gòu)，而自然殺傷細(xì)胞和單核細(xì)胞表面的是FcγRⅢa結(jié)構(gòu)。PMN以Fab端連接血小板出現(xiàn)血小板圍繞的特征，而NK細(xì)胞和單核細(xì)胞以Fc端鏈接血小板，從而引發(fā)Fc端介導(dǎo)的吞噬作用，周圍血涂片可見血小板被吞噬現(xiàn)象[24]。至于何時(shí)發(fā)生血小板聚集現(xiàn)象或血小板衛(wèi)星現(xiàn)象，原因仍不清楚，可能是存在兩種針對不同血小板GPⅡb/GPⅢa的自身抗體。而藥物引起PTCP的產(chǎn)生機(jī)制與EDTA-PTCP相似，是人鼠嵌合Fab片段單抗能結(jié)合血小板GPⅡb/GPⅢa復(fù)合物的β3亞基，引起血小板膜構(gòu)象改變，進(jìn)而發(fā)生EDTA-PTCP[25]。

3 檢測PTCP的重要性

PTCP可發(fā)生于自身免疫病、炎癥、病毒或細(xì)菌感染、代謝綜合征、腫瘤、干細(xì)胞移植患者及妊娠者中。健康人群中也可發(fā)生PTCP，且維持長久，提示這類自身抗體與人群未來患病之間并無關(guān)聯(lián)。PTCP患者無出血或血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)，不必進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)室檢查或治療。但有報(bào)道患者因PTCP而被收治入院進(jìn)行不必要的治療[26-27]，如單采血小板輸注，骨髓穿刺與活檢術(shù)，長期皮質(zhì)醇激素治療，脾切除手術(shù)，也有誤診為血小板減少癥，給患者帶來不必要的身心壓力。報(bào)道對低溫心臟手術(shù)的PTCP患者，即使體溫降到28～30 ℃仍可行冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)或瓣膜置換手術(shù)[28]。Sweeney等[29]報(bào)道輸注PTCP供體血液后未見輸血不良反應(yīng)及PTCP，提示PTCP健康人群血液制品可用于輸血治療。另有報(bào)道，急性冠脈綜合征患者中，因PTCP而未能及時(shí)進(jìn)行肝素、溶栓治療導(dǎo)致不良后果發(fā)生[30]。所以PTCP的重要性在于準(zhǔn)確判斷、及時(shí)糾正血小板結(jié)果，從而避免不合理的檢查、輸血及疾病誤診、誤治。

4 實(shí)驗(yàn)室解決方法

血小板聚集成團(tuán)后體積大小等同或大于白細(xì)胞，根據(jù)血細(xì)胞分析儀的電阻抗原理，儀器將聚集成團(tuán)的血小板誤認(rèn)為白細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，導(dǎo)致白細(xì)胞計(jì)數(shù)假性升高和PTCP。因此，檢驗(yàn)人員必須重視EDTA-PTCP，確定EDTA-PTCP快速、直觀的方法是血涂片人工顯微鏡檢查，一旦發(fā)現(xiàn)血小板聚集現(xiàn)象，標(biāo)本需采用其他方法檢測。而在添加上述抗凝劑的采血管尚未商品化之前，更換枸櫞酸鈉抗凝劑或末梢血采血檢查具有一定可操作性。然而仍需警惕無法糾正的少數(shù)案例，即更換枸櫞酸鈉抗凝管也不能糾正血小板結(jié)果的情況。而末梢血顯微鏡計(jì)數(shù)血小板盡管存在重復(fù)性與精密度等問題，目前而言仍不失為一種血小板計(jì)數(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法。文獻(xiàn)報(bào)道外周血涂片顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)血小板聚集后的解決方法[4]：首先排除靜脈穿刺不順、抗凝劑比例不當(dāng)或標(biāo)本未及時(shí)混勻等不恰當(dāng)?shù)臉?biāo)本采集方式；然后使用37 ℃預(yù)熱管采集，并置于37 ℃恒溫箱中直至檢測，采用急診或優(yōu)先模式上機(jī)檢測，確保標(biāo)本未冷卻，不推薦對冷卻標(biāo)本反復(fù)溫浴、檢測；按上述操作檢測后，仍有10%～20%病例存在EDTA-PTCP，則提示存在IgM抗體。此類標(biāo)本使用枸櫞酸鈉管也不能糾正血小板結(jié)果，建議采集末梢血進(jìn)行改良牛鮑氏手工計(jì)數(shù)血小板；最后登記患者信息，告知患者下次血常規(guī)檢查時(shí)需37 ℃恒溫采血，或末梢采血計(jì)數(shù)血小板。

總之，PTCP發(fā)生與血液分析儀自動(dòng)化程度或真空采集管使用有密切關(guān)系，國外自動(dòng)化程度起步較早，相應(yīng)報(bào)道比較多且全面。隨著我國檢驗(yàn)科自動(dòng)化儀器及真空采集管的普遍運(yùn)用，這種EDTA-PTCP也漸漸為檢驗(yàn)工作者熟悉。盡管儀器能快速地提供血常規(guī)結(jié)果，局限在于不能很好地提示EDTA-PTCP，對于患者無瘀點(diǎn)、瘀斑等血小板減少癥相關(guān)表現(xiàn)的血小板嚴(yán)重減少標(biāo)本必須進(jìn)行顯微鏡人工鏡檢復(fù)核，可避免誤診以及所帶來的不必要后果。

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R446

A

2017-03-03)

(本文編輯王海燕)

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81572064)；上海市衛(wèi)生計(jì)生系統(tǒng)重要薄弱學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(2015ZB0201)。

朱建鋒，1977年生，男，主管技師，大學(xué)本科，主要從事外周血與骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查工作。

潘柏申，研究員，E-mail：pan.baishen@zs-hospitial.sh.cn。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.09.12