洪倩+王實(shí)+陳昌秀+掌瑜+王陽(yáng)+樊媛++馬增春

[摘要]該研究通過(guò)對(duì)小鼠神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞（BV2）體外模擬腦缺血再灌注（oxygen and glucose deprivation/reoxygenation， OGD/R）損傷探討血塞通注射液（XST）抗炎癥反應(yīng)的作用及可能的作用機(jī)制。BV2細(xì)胞OGD損傷4 h后，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞存活率（MTS法）確定復(fù)氧時(shí)間及血塞通給藥濃度，采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中炎癥因子TNFα，IL1β，IL6及IL10的分泌水平，蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)細(xì)胞中pERK，pJNK，pp38蛋白表達(dá)水平的變化，免疫熒光法檢測(cè)NFκB p65的核轉(zhuǎn)位水平。結(jié)果顯示XST 25 mg·L-1可顯著提高OGD 4 h/R 6 h引起的細(xì)胞活力的下降，并抑制TNFα，IL1β，IL6及IL10的分泌水平的增高，同時(shí)XST能下調(diào)OGD/R誘導(dǎo)的pJNK，pp38蛋白表達(dá)的升高，并逆轉(zhuǎn)NFκB p65的核轉(zhuǎn)位。以上研究結(jié)果表明 XST對(duì)OGD/R損傷的BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有顯著的抑制作用，其作用機(jī)制可能與抑制前炎癥因子的分泌，調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路及核轉(zhuǎn)錄因子NFκB p65有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]血塞通注射液； 體外模擬腦缺血再灌注； 炎癥因子； MAPK； NFκB p65

缺血性腦卒中是常見(jiàn)多發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，約占腦卒中的60%～80%[1]，是世界范圍內(nèi)危害人類(lèi)健康的重要疾病之一。已有研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞激活后的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答參與介導(dǎo)缺血性腦卒中的腦損傷過(guò)程[2]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）中參與免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞類(lèi)型，約占所有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的5%～20%[3]。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)分泌釋放TNFα，IL1β，IL6，IL10等促炎因子以及NO，ROS等細(xì)胞毒性因子造成CNS神經(jīng)元損傷[4]。血塞通注射液（Xuesaitong injection，XST）含三七總皂苷，三七長(zhǎng)于止血、活血、消腫止痛，藥理研究表明，三七有增加冠狀動(dòng)脈血流量、擴(kuò)張血管、降低動(dòng)脈血壓、降低心肌耗氧量、抑制血小板聚集、降低血黏度等作用。實(shí)驗(yàn)研究也表明，三七總皂苷制劑具有通利血脈、祛瘀化滯之功，能保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬功能以及膠質(zhì)細(xì)胞的修復(fù)功能，對(duì)腦梗死有確切的治療作用[57]。本研究采用BV2細(xì)胞體外模擬腦缺血再灌注損傷，考察XST對(duì)體外OGD/R誘導(dǎo)BV2神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)及相關(guān)的信號(hào)通路的影響，闡明XST抗炎的分子機(jī)制。

1材料

11細(xì)胞株BV2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培養(yǎng)基加青霉素100 U·mL-1、鏈霉素100 mg·L-1，置37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔24 h換1 次培養(yǎng)液，48 h傳代1次。

12藥物與試劑血塞通注射液（XST，云南白藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)XBl2002）；金納多注射液（JND，批號(hào)H6138）；DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基及胎牛血清（Gibco公司）；青鏈霉素混合液（100×）（Biotopped公司）；胰蛋白酶（Amresco公司）；MTS試劑盒（Promega公司）；蛋白質(zhì)提取試劑盒（QiaGen公司）；腫瘤壞死因子（TNFα）、炎癥因子IL1β，IL6，IL10 ELISA試劑盒（eBioscience公司）；抗體：GAPDH Rabbit mAb，p38 MAPK Antibody，Phosphop38 MAPK （Thr180/Tyr182） Rabbit mAb，SAPK/JNK（56G8） Rabbit mAb，PhosphoSAPK/JNK （Thr183/Tyr185） Rabbit mAb，p44/42 MAPK （Erk1/2） Antibody，Phosphop44/42 MAPK （Erk1/2） （Thr202/Tyr204） Antibody，NFκB p65 Rabbit mAb，PhosphoNFκB p65（Ser536） Rabbit mAb（CST公司）。

13儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；Eppendorf 5810R型高速冷凍多用途離心機(jī)（德國(guó)）；缺氧小室購(gòu)自加拿大Stemcell公司；微孔板檢測(cè)系統(tǒng)Flex Station 3購(gòu)自美國(guó)MD公司；ChemiDoc XRS系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Biorad公司；Leica DMI 4000B熒光倒置顯微鏡購(gòu)于德國(guó)徠卡公司。

2方法

21體外模擬腦缺血再灌注（OGD/R）模型的建立體外模擬腦缺血再灌注（OGD/R）模型的建立參考文獻(xiàn)方法并根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果略作改動(dòng)[8]。細(xì)胞按一定密度接種于96孔板或6孔板中，培養(yǎng)24 h后，棄上清，用無(wú)糖、無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基更換，置于缺氧小室中，用95%氮?dú)狻?%CO2混合氣體連續(xù)通氣20 min，控制進(jìn)氣流量為20 L·min-1。隨后，將出氣閥夾緊并將小室置于37 ℃CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。缺氧4 h后，氧糖剝奪試驗(yàn)結(jié)束，將細(xì)胞置于二氧化塘培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)（37 ℃，95%空氣，5%CO2），復(fù)氧同時(shí)分別給予血塞通及金納多注射液處理細(xì)胞，按照不同試驗(yàn)需要復(fù)氧培養(yǎng)一定時(shí)間。

22細(xì)胞活力測(cè)定將BV2細(xì)胞以15×104個(gè)/100 μL/孔的密度接種至96孔板中，OGD 4 h后加入不同濃度的血塞通注射液（625，125，25，50，100 mg·L-1），分別復(fù)氧15，3，6，12 h，復(fù)氧結(jié)束后，采用MTS試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力，按說(shuō)明書(shū)加入20 μL MTS，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h后，于490 nm處測(cè)定各組吸光度A490。

23酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)炎癥因子表達(dá)將BV2細(xì)胞以15×104個(gè)/100 μL/孔的密度接種至96孔板中，按照OGD 4 h/R 6 h執(zhí)行體外氧糖剝奪試驗(yàn)，復(fù)氧同時(shí)給藥，復(fù)氧3 h后分別收集各組細(xì)胞上清液-80 ℃保存，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定各組細(xì)胞上清液中腫瘤壞死因子（TNFα）、炎癥因子IL1β，IL6和IL10水平。

24Western blot檢測(cè)蛋白質(zhì)水平將BV2細(xì)胞以10×106個(gè)/mL/孔的密度接種于6孔板中，按照OGD 4 h/R 6 h執(zhí)行體外氧糖剝奪試驗(yàn)，復(fù)氧同時(shí)給藥，復(fù)氧結(jié)束后收集各組細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取總蛋白，應(yīng)用BCA法測(cè)定樣品蛋白濃度。經(jīng)SDSPAGE電泳后，電轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜，封閉，分別加入1∶1 000稀釋的兔抗小鼠的p38，Phosphop38 MAPK （Thr180/Tyr182），SAPK/JNK（56G8），PhosphoSAPK/JNK （Thr183/Tyr185），p44/42 MAPK （Erk1/2），Phosphop44/42 MAPK （Erk1/2） （Thr202/Tyr204）一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶2 000）溶液室溫孵育2 h后洗滌膜，ECL法顯影，應(yīng)用ChemiDoc XRS系統(tǒng)拍照，采用GelPro analyzer 4圖像分析軟件進(jìn)行顯影條帶灰度值分析。

25免疫熒光檢測(cè)NFκB p65核轉(zhuǎn)位為檢測(cè)BV2細(xì)胞NFκB p65在細(xì)胞中的定位，采用免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)OGD/R引起的NFκB p65核轉(zhuǎn)位及藥物的抑制作用。將BV2細(xì)胞以80×104個(gè)/100 μL/孔的密度接種于96孔板中，24 h后按照OGD 4 h/R 1 h執(zhí)行氧糖剝脫試驗(yàn)，復(fù)氧同時(shí)分別給予50 mg·L-1血塞通及金納多注射液處理細(xì)胞1 h。復(fù)氧結(jié)束后，用1×PBS輕輕洗細(xì)胞1次，每孔加入150 μL 4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15 min，1×PBS洗細(xì)胞1次，每孔加入含03% Triton X100的1% BSA室溫透化、封閉細(xì)胞1 h，1×PBS洗細(xì)胞1次，然后每孔加入100 μL兔抗小鼠NFκB p65一抗（1∶100稀釋?zhuān)?7 ℃孵育2 h（或4 ℃過(guò)夜），1×PBS洗細(xì)胞3次，加入山羊抗兔IgGCFL 488二抗（1∶250稀釋?zhuān)?7 ℃培養(yǎng)2 h，1×PBS洗細(xì)胞3次，加入終濃度為2 mg·L-1 Hoechst 33258染核，孵育10 min后1×PBS洗細(xì)胞1次，用Leica DMI 4000B熒光倒置顯微鏡檢測(cè)NFκB p65在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的表達(dá)，評(píng)價(jià)其轉(zhuǎn)核情況及藥物的抑制作用。

26統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS Statistics V170軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，OneWay ANOVA分析比較各組均數(shù)之間的差異，以P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

31XST對(duì)OGD/R損傷的BV2細(xì)胞的保護(hù)作用為了探討XST對(duì)OGD/R損傷的BV2細(xì)胞的影響，本研究采用MTS法對(duì)不同條件處理后的BV2細(xì)胞活力進(jìn)行了檢測(cè)。為獲得最佳的OGD/R條件及藥物給藥濃度，本試驗(yàn)對(duì)BV2細(xì)胞OGD時(shí)間，復(fù)氧時(shí)間及XST給藥濃度進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，OGD 1～4 h后，A490明顯降低，與正常組比較有顯著性差異，以O(shè)GD 4 h細(xì)胞活力下降最低（P<001）（圖1）。隨后檢測(cè)了不同復(fù)氧時(shí)間點(diǎn)BV2細(xì)胞的活力，結(jié)果顯示，XST作用質(zhì)量濃度25 mg·L-1可顯著提高OGD 4h/R 6 h組的細(xì)胞活力（P<005），因此選擇復(fù)氧6 h作為后續(xù)對(duì)XST給藥濃度的考察及后續(xù)試驗(yàn)條件（圖1）。復(fù)氧階段加X(jué)ST質(zhì)量濃度達(dá)25，50 mg·L-1可顯著提高細(xì)胞活力（P<001）（圖1），給藥濃度為625，125，100 mg·L-1時(shí)無(wú)顯著性差異。因此選擇給藥濃度25 mg·L-1為后續(xù)試驗(yàn)條件。

與對(duì)照組相比1）P<005，2）P<001；與OGD/R組相比3）P<005，4）P<001（圖2，3同）。

缺血性腦卒中通過(guò)一系列復(fù)雜的病理生理事件導(dǎo)致腦損傷，而炎癥反應(yīng)已被證實(shí)為其中的一個(gè)關(guān)鍵因素[9]。缺血性腦卒中炎癥反應(yīng)的主要機(jī)制是激活小膠質(zhì)細(xì)胞，從而進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)元的死亡，小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種特殊的巨噬細(xì)胞[10]。小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化是導(dǎo)致神經(jīng)炎癥介質(zhì)（細(xì)胞因子和趨化因子）誘導(dǎo)的疾病進(jìn)展的本質(zhì)，能增強(qiáng)神經(jīng)元損傷。血塞通注射液是從三七中提取有效活性成分而制成的注射液，主要含人參皂苷和三七皂苷，臨床主要用于緩解腦梗死，動(dòng)脈粥樣硬化，腦栓塞，視網(wǎng)膜靜脈阻塞等癥狀。此外，體外研究表明血塞通注射液能不同程度地抑制ADP和血管膠原誘導(dǎo)的人血小板聚集，其抗血小板聚集作用與拮抗血小板活化因子（PAF）有關(guān)[1112]。然而，血塞通注射液對(duì)腦缺血神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞激活引起的炎癥反應(yīng)有無(wú)影響一直未得到明確地闡明。 已有研究表明，激活神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞能引起其過(guò)度

增殖并向炎癥部位遷移從而分泌大量的神經(jīng)毒性物質(zhì)及前炎癥因子介導(dǎo)的神經(jīng)損傷[1314]。小膠質(zhì)細(xì)胞的激活能通過(guò)釋放前炎癥因子及細(xì)胞毒因子像IL1β，IL6，TNFα，MIP1a，NO，ROS等影響神經(jīng)細(xì)胞的存活[1516]。因此，選擇能夠抑制OGD/R激活的膠質(zhì)細(xì)胞炎癥介質(zhì)分泌的藥物理論上能夠改善神經(jīng)細(xì)胞的存活。本研究通過(guò)OGD/R模型誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng)，并對(duì)血塞通注射液抗炎反應(yīng)進(jìn)行考察，同時(shí)通過(guò)對(duì)炎癥相關(guān)信號(hào)通路的檢測(cè)揭示其抗炎癥反應(yīng)可能的作用機(jī)制。

為了獲得對(duì)藥物可靠的活性評(píng)價(jià)結(jié)果，本研究首先對(duì)氧糖剝脫模型缺氧及復(fù)氧時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示BV2細(xì)胞在OGD 4 h/R 6 h后細(xì)胞活力明顯降低（約45%），而復(fù)氧12 h由于細(xì)胞活力的自身恢復(fù)導(dǎo)致模型組與正常組之間細(xì)胞活力無(wú)顯著性差異。同時(shí)25 mg·L-1XST能明顯提高OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞活力的下降，因此OGD 4 h/R 6 h條件可用于對(duì)藥物活性的評(píng)價(jià)。利用此條件對(duì)XST進(jìn)行量效關(guān)系考察，結(jié)果顯示血塞通注射液提高細(xì)胞活力為非劑量依賴性，且在25 mg·L-1對(duì)OGD/R引起的細(xì)胞損傷具有最大的保護(hù)效應(yīng)。此外，已有研究顯示神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞衍生的炎癥因子觸發(fā)有害的下游信號(hào)通路的激活并促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)一步的損傷，包括神經(jīng)元功能的破壞及直接的神經(jīng)毒性[17]。細(xì)胞活力結(jié)果顯示血塞通注射液在25 mg·L-1能顯著提高OGD/R引起的細(xì)胞活力的降低，因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中前炎癥因子的水平來(lái)考察血塞通25 mg·L-1的抗炎活性。結(jié)果顯示TNFα，IL1β，IL6，IL10水平在BV2細(xì)胞OGD/R后較基礎(chǔ)水平（正常組）明顯升高，25 mg·L-1血塞通能顯著抑制炎癥因子的分泌，減輕OGD/R引起的炎癥反應(yīng)，具有明顯的抗炎活性。結(jié)合細(xì)胞活力和前炎癥因子的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)血塞通注射液能夠提高細(xì)胞存活率，同時(shí)降低前炎癥因子水平，提示血塞通注射液可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞存活及凋亡平衡而具有抗凋亡功能。因此，在后續(xù)的研究中更進(jìn)一步的評(píng)價(jià)來(lái)揭示血塞通處理的受益是非常必須的。

盡管上述研究已經(jīng)證實(shí)血塞通具有明顯的抗炎效應(yīng)，但其作用機(jī)制仍沒(méi)有得到充分地闡明。腦缺血后神經(jīng)元的損傷通過(guò)氧化應(yīng)激，炎癥反應(yīng)或線粒體功能失調(diào)最終激活凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。MAPK信號(hào)通路作為腦缺血損傷作用的靶點(diǎn)和介質(zhì)的重要性已逐漸被認(rèn)識(shí)。出現(xiàn)在腦缺血損傷后產(chǎn)生的氧化應(yīng)激和炎癥介質(zhì)已被證實(shí)能夠激活MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)而參與神經(jīng)元的存活和損傷[1820]。由于MAPK信號(hào)通路中包含許多重要的參與小膠質(zhì)細(xì)胞分泌和調(diào)節(jié)炎癥因子的信號(hào)分子，其可能在腦缺血疾病中代表了確切的病理學(xué)基礎(chǔ)，對(duì)于OGD/R誘導(dǎo)的 MAPK信號(hào)通路研究具有重要意義[21]。為探討血塞通注射液保護(hù)小膠質(zhì)細(xì)胞免受OGD/R損傷的作用機(jī)制，本研究對(duì)OGD/R引起的BV2細(xì)胞MAPK信號(hào)通路的變化進(jìn)行了檢測(cè)，并考察血塞通注射液對(duì)MAPK蛋白磷酸化水平的影響。結(jié)果顯示OGD/R能顯著上調(diào)pERK1/2，pJNK1/2和pp38 MAPK 蛋白的表達(dá)，25 mg·L-1血塞通注射液能顯著抑制JNK1/2和p38 MAPK的激活，而對(duì)pERK1/2蛋白表達(dá)的升高無(wú)抑制作用。提示JNK1/2和p38 MAPK信號(hào)通路可能參與血塞通的神經(jīng)保護(hù)作用。

炎癥反應(yīng)已經(jīng)被越來(lái)越認(rèn)識(shí)到是腦卒中病理生理過(guò)程中重要的貢獻(xiàn)者，炎癥反應(yīng)引起一系列細(xì)胞事件，如循環(huán)免疫細(xì)胞的滲透和腦居民免疫反應(yīng)細(xì)胞的激活，包括小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等[2223]。NFκB信號(hào)通路是這些免疫反應(yīng)過(guò)程的中間調(diào)控者，參與誘導(dǎo)前致炎因子和趨化因子如IL1β，IL6，TNFα，iNOS的產(chǎn)生，進(jìn)而在腦缺血狀態(tài)下對(duì)神經(jīng)元介導(dǎo)毒性效應(yīng)[22]。本研究中OGD/R能顯著誘導(dǎo)前致炎因子的分泌，提示NFκB信號(hào)通路可能參與OGD/R誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng)過(guò)程，因此，本研究通過(guò)免疫熒光法檢測(cè)NFκB p65轉(zhuǎn)核情況來(lái)反應(yīng)NFκB信號(hào)通路是否被激活，進(jìn)而參與OGD/R誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。結(jié)果顯示，在正常組細(xì)胞中NFκB p65蛋白主要集中在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，而經(jīng)過(guò)氧糖剝脫及復(fù)氧后NFκB p65蛋白大部分在細(xì)胞核中高表達(dá)，提示OGD/R誘導(dǎo)了NFκB信號(hào)通路的活化。而給予血塞通注射液后，NFκB p65蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間得到重新分配，并大部分重新轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中，提示血塞通注射液對(duì)NFκB信號(hào)通路的激活具有顯著地抑制作用?；诖搜芯拷Y(jié)果，認(rèn)為血塞通能通過(guò)抑制NFκB信號(hào)通路削弱OGD/R損傷誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

基于本次實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，血塞通注射液能夠抑制OGD/R誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活并參與調(diào)控NFκB/MAPK信號(hào)通路的活化，減少前炎癥因子的分泌而產(chǎn)生抗炎及保護(hù)神經(jīng)元的作用。同時(shí)，血塞通注射液可能代表一種治療方法，預(yù)防在缺血性疾病中小膠質(zhì)細(xì)胞引起的損傷。進(jìn)一步的研究需要在整體動(dòng)物及原代神經(jīng)元細(xì)胞基礎(chǔ)上更深入地闡明血塞通注射液對(duì)缺血再灌注損傷的影響及可能的作用機(jī)制，為血塞通注射液在臨床用于治療中風(fēng)偏癱，淤血阻絡(luò)動(dòng)脈粥狀硬化性血栓性腦梗死、腦血栓提供中藥藥理學(xué)基礎(chǔ)。

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[責(zé)任編輯張寧寧]