陳自敏，周國梁，徐偉玲，鄭小紅，童勛章，柯起沈，宋瀏偉，葛勝祥

1 廈門大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361102

2 廈門萬泰凱瑞生物技術(shù)有限公司，福建 廈門 361026

CK-MB特異性單抗的制備方法及其應(yīng)用

陳自敏1，周國梁1，徐偉玲2，鄭小紅2，童勛章2，柯起沈2，宋瀏偉1，葛勝祥1

1 廈門大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361102

2 廈門萬泰凱瑞生物技術(shù)有限公司，福建 廈門 361026

本研究擬建立肌酸激酶同工酶MB (CK-MB) 特異性單克隆抗體 (mAb) 的研制方法，對抗CK-MB單抗進(jìn)行評價(jià)分類及性質(zhì)鑒定，并初步建立CK-MB定量檢測試劑。以CK-MB抗原免疫BALB/c小鼠，利用常規(guī)單抗制備技術(shù)，使用間接和捕獲ELISA差異篩選法篩選單抗。利用肌酸激酶同工酶 (CK-MM/BB/MB) 抗原對所制備單抗的抗原識別表位進(jìn)行鑒定，另通過免疫印跡法及合成CK-MM、CK-BB差異性的線性表位肽鑒定對所制備的單抗進(jìn)行評價(jià)分類。使用雙抗體夾心ELISA方法篩選檢測CK-MB抗原的配對mAb，并初步建立CK-MB定量檢測試劑。使用74例臨床標(biāo)本初步評價(jià)該試劑與羅氏試劑的檢測一致性。最終，我們成功篩選到22株穩(wěn)定分泌抗CK-MB抗體的雜交瘤細(xì)胞株，這些單抗可以分為線性、偏構(gòu)象的CK-MB和CK-MM或者CK-BB交叉的單抗以及與CK-MB特異反應(yīng)的偏構(gòu)象型單抗，并使用偏構(gòu)象型單抗研制出CK-MB定量檢測試劑，該試劑與羅氏試劑相關(guān)系數(shù)r達(dá)到0.930 9。綜上所述，本研究建立了研制CK-MB偏構(gòu)象型特異性單抗的篩選方法，通過對所篩選的單抗進(jìn)行分析鑒定并建立了CK-MB定量檢測試劑，與羅氏試劑檢測結(jié)果符合率高。

肌酸激酶同工酶MB (CK-MB)，急性心肌梗死 (AMI)，單克隆抗體，構(gòu)象型單抗，捕獲法

急性心肌梗死 (AMI) 已經(jīng)成為威脅人類生命的主要疾病之一，目前全球每年有1 700萬人死于心血管疾病，其中有一半以上死于急性心肌梗死[1]，AMI過程中心肌細(xì)胞中的酶，如肌酸激酶 (CK)、門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (AST) 和乳酸脫氫酶 (LDH) 在血清中活性增高，廣泛應(yīng)用于AMI的診斷。心肌是唯一一個含有肌酸激酶同工酶MB (CK-MB) 較多的器官，CK-MB是心肌類疾病早期診斷的重要指標(biāo)。健康人血清中肌酸激酶同工酶MM (CK-MM) 占94%–96%，CK-MB僅占5%以下，若血清中CK-MB顯著增高，說明心肌受損，一般認(rèn)為血清中CK-MB大于總活性的6%以上為心肌損傷的特異性指標(biāo)[2-3]。

CK是由腦型亞單位B和肌型亞單位M組成的二聚體，每個亞單位的分子量都約為43 kDa，M亞基與B亞基在一級結(jié)構(gòu)上的同源性達(dá)80%，在高級結(jié)構(gòu)上會形成3種二聚體，有CK-MM、CK-BB、CK-MB三種同工酶。目前傳統(tǒng)的區(qū)分 3種同工酶的方法主要是基于 3種蛋白帶電荷的不同采用非變性電泳鑒定[4]。CK-M與CK-B亞基在形成異源二聚體的時候各自都發(fā)生了變構(gòu)形成新的構(gòu)象型表位[5]。人體很多組織中都含有肌酸激酶，但是每一種同工酶的分布都不一樣，骨骼肌中富含有 CK-MM型同工酶，腦、胃、小腸、膀胱以及肺主要含有CK-BB同工酶，而CK-MB僅存在于心肌組織中。CK-MB診斷透壁型心肌梗死的敏感性及特異性均極高，在發(fā)病后4 h其含量增高，在16–24 h達(dá)到高峰，3–4 d恢復(fù)正常。若CK-MB在急性心肌梗死 (AMI) 后仍保持高水平，表明心肌壞死還在進(jìn)行；若恢復(fù)正常后再次升高，說明原梗死部位擴(kuò)展或者新的梗死部位出現(xiàn)[6]。目前CK-MB的診斷原料以及試劑大多都是依賴于國外進(jìn)口，昂貴的成本導(dǎo)致醫(yī)院檢測價(jià)格居高不下。因此，本研究通過建立CK-MB單抗的篩選方法，對CK-MB單抗進(jìn)行篩選和分類評價(jià)，初步建立 CK-MB定量的雙抗體夾心法定量檢測試劑，為CK-MB試劑和原料的國產(chǎn)化奠定重要的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

CK-MB、CK-MM、CK-BB抗原均購于Meridian公司 (分別的批號是VTI820、VTI830、VT810)。利用購買的抗原進(jìn)行變性膠以及非變性膠鑒定，結(jié)果顯示與文獻(xiàn)描述一致。小鼠骨髓瘤細(xì)胞株 SP2/0購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)。BALB/c小鼠為上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物中心提供。PEG1500、次黃嘌呤、胸腺嘧啶、氨基喋呤、DMSO和辣根過氧化物酶 (HRP)等購自Sigma公司。RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自Gibco公司。胎牛血清購自PAA公司。

1.1.2 樣本

選取2014年10月至2015年10月廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院收集的臨床樣本，來源于門診住院病人，其中確診AMI的76例 (AMI的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照全國中西醫(yī)結(jié)合防治冠心病、心絞痛、心律失常研究座談會修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)和WHO缺血性心臟病診斷標(biāo)準(zhǔn))。

1.2 方法

1.2.1 單抗制備

選擇6只雌性BALB/c 小鼠以CK-MB抗原乳化完全弗氏佐劑 (CFA) (Sigma，St. Louis，MO) 皮下免疫，兩周后使用同樣的抗原乳化不完全弗氏佐劑 (IFA) (Sigma，St. Louis，MO) 進(jìn)行免疫，間隔2周繼續(xù)免疫2針。最后使用相同的抗原PBS稀釋脾臟免疫最后加強(qiáng)，采集血清3 d后開展細(xì)胞融合。細(xì)胞融合、克隆化、腹水制備以及純化均按照常規(guī)方法[7]。

1.2.2 單抗的篩選方法

1) 間接法篩選：3種CK-MM/BB/MB抗原用碳酸緩沖液 (20 mmol/L CB，pH 9.6) 稀釋后包被于聚氯乙烯板上，然后加入待檢樣品，最后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗 (保存于20 mmol/L PBS (pH 7.4) 中，含有酪蛋白與明膠)。2) 捕獲法篩選：羊抗鼠多抗 (GAM) 用20 mmol/L PBS緩沖液 (pH 7.4) 稀釋后包被于聚苯乙烯板上，然后加入待檢樣品 (保存于 20 mmol/L PBS，pH 7.4) 即捕獲所有的鼠源單抗，最后加入HRP標(biāo)記的3種抗原 (CK-MM/BB/MB) 進(jìn)行差異性篩選。

1.2.3 單抗性質(zhì)鑒定分析

1) mAb間接法滴度測定：采用3種抗原包被檢測抗體的活性滴度即利用 CK-MM/BB/MB抗原用碳酸緩沖液 (20 mmol/L CB，pH 9.6) 稀釋后包被于聚氯乙烯板上，然后加入待檢樣品，最后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗。2) mAb捕獲法滴度測定：采用GAM包被捕獲不同單抗后用3種標(biāo)記 HRP的抗原檢測抗體的活性滴度。3)免疫印跡法評價(jià)單抗性質(zhì)：3種抗原(CK-MM/ BB/MB)包被于硝酸纖維素膜上，用 5%脫脂奶進(jìn)行封閉 (Blocking) 1 h后，進(jìn)行1–22株不同單抗的分別孵育 (即Primary antibody incubation，使用比例：5 μg/mL) 1 h，然后用洗液 (20 mmol/L PBS (pH 7.4)+0.05% Tween20) 洗滌，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG (GAM-AP) 孵育 (即Secondary antibody incubation) 反應(yīng)1 h，最后用洗液洗滌，顯色液 (購自北京萬泰生物技術(shù)有限公司) 顯色15 min后，終止觀察反應(yīng)情況。4) 單抗的線性差異性表位驗(yàn)證：通過比對CK-MM與CK-BB的序列發(fā)現(xiàn)在258–272 aa (CK-MM 是QKIEEIFKKAGHPFM；CK-BB是TQIETLFKSK DYEFM) 之間存在較明顯的連續(xù)差異，合成兩個15 aa的短肽包被驗(yàn)證其22株單抗的活性和特異性。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)建立

采用方陣滴定法篩選配對單抗，選擇抗原濃度為 1 ng/mL檢測值進(jìn)行正交配對篩選，后續(xù)繼續(xù)優(yōu)化以靈敏度高、本底低、線性范圍廣為選擇標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 磁微粒包被單克隆抗體

取 4 mg磁微粒用 EDC 溶液 (10 mg EDC·HCl溶于1 mL去離子水) 活化，然后加入80 μg單克隆抗體并置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上孵育偶聯(lián)，孵育后用1 mL 1%甘氨酸溶液 (pH 7.4) 進(jìn)行封閉，完成封閉后保存在含酪蛋白的PBS緩沖液中。

1.2.6 吖啶酯標(biāo)記單克隆抗體

取單克隆抗體稀釋到合適濃度后加入吖啶酯 (溶于甲基甲酰胺中)，混勻，室溫避光反應(yīng)；加入賴氨酸溶液 (pH 8.0) 封閉；最后用PBS緩沖液 (20 mmol/L PBS，pH 7.4) 透析，用含酪蛋白的PBS緩沖液稀釋后使用。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

單抗6種活性評價(jià)方法采用GPS統(tǒng)計(jì)軟件處理；試劑與同類產(chǎn)品的比較采用 GraphPad Prism統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 CK-MB單克隆抗體的制備與鑒定

利用間接ELISA法以及捕獲ELISA常規(guī)單抗制備篩選技術(shù)，獲得了22株CK-MB單抗。

2.2 單抗活性評價(jià)

將所篩選的單抗分別用間接ELISA以及捕獲 ELISA法進(jìn)行抗體的活性評價(jià)及鑒定 (檢測的抗體量是1 μg/mL)，不同單抗與3種抗原兩種不同檢測方法 (間接法、捕獲法) 的反應(yīng)性結(jié)果見圖 1。根據(jù)反應(yīng)性圖譜，22株單抗可以分為6大類，分別是：Ⅰ類單抗是CK-MM/BB/MB三種抗原間接、捕獲法均反應(yīng)；Ⅱ類、Ⅲ類單抗分別是CK-MM/MB、CK-BB/MB兩種抗原間接、捕獲法均反應(yīng)；Ⅳ類、Ⅵ類單抗分別是CK-MM/MB、CK-BB/MB 2種抗原捕獲法反應(yīng)；以及Ⅴ類單抗是只與CK-MB捕獲法反應(yīng)。

2.3 免疫印跡法評價(jià)單抗性質(zhì)

免疫印跡法評價(jià)單抗的性質(zhì)結(jié)果見圖2。從評價(jià)結(jié)果可知，Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ類單抗均可與硝酸纖維素膜上的抗原反應(yīng)，交叉反應(yīng)模式與ELISA檢測基本一致，而Ⅳ/Ⅴ/Ⅵ類抗體在對硝酸纖維素膜上的抗原基本不反應(yīng)或者是對 CK-MB有很微弱的反應(yīng)。初步認(rèn)為是抗原在固相上展示的表位與液相上的差異。

圖1 單抗6種活性評價(jià)方法圖譜Fig. 1 Mapping of evaluation for the activity of monoclonal antibodies using 6 methods.

圖2 免疫印跡法評價(jià)單抗性質(zhì)圖譜Fig. 2 Evaluation of monoclonal antibodies with immune blotting method.

2.4 線性表位驗(yàn)證單抗性質(zhì)

線性表位驗(yàn)證單抗性質(zhì)結(jié)果見圖 3 (檢測的抗體量是10 μg/mL)。從結(jié)果可知，Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ類單抗對CK-MM與CK-BB的兩個在258–272 aa的線性表位有反應(yīng)，而后也存在差異性反應(yīng)的單抗，而Ⅳ/Ⅴ/Ⅵ類單抗對這兩個線性表位都不反應(yīng)。初步推測Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ類單抗是偏線性表位的單抗。

2.5 單抗配對篩選

圖3 線性表位評價(jià)單抗性質(zhì)圖譜Fig. 3 Mapping of linear epitope evaluation of monoclonal antibody properties.

圖4 抗體正交配對評價(jià)Fig. 4 Evaluation of the cross reaction with antibodies.

將獲得的22株單抗分別標(biāo)記HRP，使用3種抗原進(jìn)行正交配對檢測結(jié)果見圖 4，其中CK-MM/CK-BB使用濃度是500 ng/mL，CK-MB使用濃度是100 ng/mL。從結(jié)果可知，Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ單抗與現(xiàn)有所有類單抗正交配對顯示部分單抗無法交叉配對，部分單抗交叉配對后存在CK-MM/BB的交叉反應(yīng)，故這3類間接方法篩選的單抗都無法應(yīng)用在 CK-MB檢測試劑中。Ⅳ/Ⅴ/Ⅵ三類單抗相互之間正交配對結(jié)果顯示存在特異性檢測 CK-MB的配對，也存在Ⅵ類單抗相互之間配對存在的CK-BB的交叉，目前認(rèn)為紅色標(biāo)記的方框中是相互之間配對可以特異性檢測出 CK-MB的配對。根據(jù)圖 4的結(jié)果選擇了幾個較優(yōu)的配對進(jìn)行抗原的線性測定以及兩份 Roche背景高值、低值樣本以及小牛血清和正常人樣本的評價(jià)，配對分別是：Ⅳ類(E19B12)-Ⅵ類(D22G9)、Ⅴ類 (B14H8)-Ⅵ類(D22G9)、Ⅴ類 (B14H8)-Ⅳ類 (E19B12)、Ⅵ類(D22G9)-Ⅳ類 (E19B12)和Ⅵ類 (D22G9)-Ⅴ類(B14H8)，結(jié)果見圖 5。從結(jié)果中可知，Ⅵ類(D22G9)-Ⅳ類 (E19B12) 配對對抗原的線性檢測以及對血清的評價(jià)都比其他配對優(yōu)越。后續(xù)將該配對應(yīng)用到管式發(fā)光化學(xué)平臺。2.6 單抗在管式化學(xué)發(fā)光平臺原料的應(yīng)用

利用該配對初步建立定量的檢測 CK-MB特異性檢測試劑，用Roche公司生產(chǎn)的CK-MB電化學(xué)發(fā)光試劑平行檢測74份血清樣本檢測結(jié)果經(jīng)線性回歸分析 (r2=0.930 9，P＜0.000 1)，顯示兩者檢測結(jié)果無顯著差異，具有很好的相關(guān)性，結(jié)果見圖6。

圖5 比較不同抗體配對評價(jià) (A) CK-MB抗原和 (B) 樣本Fig. 5 Comparison of different pairs of antibodies in detection of CK-MB antigen (A) and samples (B).

圖6 與同類試劑比較Fig. 6 Comparison with similar assay.

3 討論

CK及其同工酶 CK-MB是心肌梗死在血清中出現(xiàn)較早的兩種酶，它們在心肌中的含量相對較高，特別是 CK-MB，約占心肌酶的20%[8]。隨著試驗(yàn)技術(shù)的快速發(fā)展，聯(lián)合檢測cTnI、肌紅蛋白、CK-MB對早期診斷AMI具有重要的臨床意義，目前已經(jīng)在多個檢測平臺廣泛推廣[9-19]。

本研究利用外購的CK-MB抗原免疫、并通過購買的CK-MM/BB/MB抗原建立固相包被間接法和液相標(biāo)記捕獲法的單抗篩選方法，總共篩選出22株單抗，并利用6種方法對單抗進(jìn)行分類以及鑒定，大體上可以分為 5類單抗分別為Ⅰ類單抗是CK-MM/BB/MB三種抗原固相包被、液相標(biāo)記均反應(yīng)；Ⅱ類、Ⅲ類單抗分別是CK-MM/MB、CK-BB/MB兩種抗原固相包被、液相標(biāo)記均反應(yīng)；Ⅳ類、Ⅵ類單抗分別是CK-MM/MB、CK-BB/MB兩種抗原液相標(biāo)記反應(yīng)；以及Ⅴ類單抗是只與CK-MB抗原液相標(biāo)記反應(yīng)。還利用了免疫印跡法以及 CK-MM 和CK-BB差異性的線性表位肽鑒定，發(fā)現(xiàn)Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ類單抗存在免疫印跡以及差異表位肽的反應(yīng)，而后Ⅳ/Ⅴ/Ⅵ類單抗都不反應(yīng)。通過單抗的性質(zhì)鑒定等分析，我們進(jìn)一步推測間接法與捕獲法都反應(yīng)的單抗大多都是偏向線性單抗，或者說固相包被檢測篩選獲得的單抗都是偏向線性的抗體。我們將這些不同類單抗進(jìn)行正交配對，結(jié)果顯示與抗原固相包被在板的 3種反應(yīng)模式的單抗與其他類單抗之間配對存在交叉反應(yīng)或者是不反應(yīng)，而液相方式反應(yīng)的 3類單抗相互之間配對存在對 CK-MB特異性反應(yīng)的配對。挑選這些不同類別之間配對進(jìn)一步評價(jià)發(fā)現(xiàn)D22G9與E19B12配對對抗原以及樣本的檢測都較優(yōu)，利用該配對初步建立了特異性檢測CK-MB的定量試劑。與同類的產(chǎn)品進(jìn)行比較r2=0.930 9，P＜0.000 1，表明二者具有良好的的相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示固相包被抗原有反應(yīng)的抗體都無法特異性檢測CK-MB，都會存在交叉反應(yīng)，預(yù)測可能固相包被檢測有反應(yīng)的單抗識別的是偏線性的表位，即可能檢測的是CK-MB與CK-BB或者CK-MM有交叉的線性表位；而后液相標(biāo)記捕獲篩選到的單抗存在可以特異性檢測CK-MB的抗體，預(yù)測可能液相標(biāo)記檢測反應(yīng)的單抗識別的是偏構(gòu)象的表位，及M和B亞型形成的異源二聚體的構(gòu)象表位。而這種構(gòu)象型表位比較脆弱，如果采用間接法固相吸附包被容易破壞該表位，而利用捕獲法篩選可以使抗原一直保存在液相狀態(tài)，保證構(gòu)象表位穩(wěn)定從而有利于獲得構(gòu)象型表位單抗。

肌酸激酶 MB同工酶目前多數(shù)用免疫抑制法測定 CK-MB酶活性，特異性差而且干擾嚴(yán)重，目前國內(nèi)有多家公司研制出CK-MB雙抗夾心檢測試劑[20-22]，包括熒光免疫層析以及膠體金免疫層析法，因此對CK-MB的抗體原料需求很大，但目前國內(nèi)的試劑大多都是依托進(jìn)口原料，大大提高了試劑的成本。而本研究生產(chǎn)的抗體原料初步試劑評價(jià)與進(jìn)口原料相當(dāng)，從而極大地提高了本土原料的競爭力。

總之，本研究建立一套利用捕獲法來保證抗原處于液相狀態(tài)的篩選模式，該篩選模式能夠更好地獲得針對偏構(gòu)象表位的單抗，并可以建立特異性檢測CK-MB的定量檢測試劑。同時也初步闡明腦型亞單位B和肌型亞單位M形成的同源二聚體CK-MM、CK-BB，與異源二聚體CK-MB所形成的構(gòu)象不同，也進(jìn)一步闡明想通過基因重組技術(shù)獲得類似 CK-MB天然抗原是有一定難度的[23-25]，以及獲得特異性識別CK-MB的單抗必須篩選識別偏構(gòu)象型表位的單抗，這也為后續(xù)CK-MB結(jié)構(gòu)的研究提供幫助。此外，對于其他抗原構(gòu)象型表位比較脆弱，也可以借鑒該篩選方法制備單抗。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Development and application of CK-MB specific monoclonal antibodies

Zimin Chen1, Guoliang Zhou1, Weiling Xu2, Xiaohong Zheng2, Xunzhang Tong2, Qishen Ke2, Liuwei Song1, and Shengxiang Ge1

1 National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infectious Diseases, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, Fujian, China
2 Xiamen Innodx Biotech Co., Ltd., Xiamen 361026, Fujian, China

The aim of this study is to develop creatine kinase isoenzyme MB (CK-MB) specific monoclonal antibodies (mAb), and characterize the monoclonal antibody and further development of quantitative detection assay for CK-MB. The BALB/c mice were immunized with purchased CK-MB antigen, then monoclonal antibodies were prepared according to conventional hybridoma technique and screened by indirect and capture ELISA method. To identify the epitopes and evaluate the classification, purchased creatine kinase isoenzyme MB (CK-MM/BB/MB) antigen was used to identify the epitopes, with immunoblotting and synthetic CK-MM and CK-BB in different linear epitope. A double antibody sandwich ELISA was applied to screen the mAb pairs for CK-MB detection, and the quantitative detection assay for CK-MB was developed. We used 74 cases of clinical specimens for comparison of our assay with Roche’s CK-MB assay. We successfully developed 22 strains of hybridoms against CK-MB, these mAbs can be divided into linear, partial conformational CK-MB, CK-MM or CK-BB cross monoclonal antibody and CK-MB specific reaction with partial conformational monoclonal antibody, and CK-MB quantitative detection assay was developed by using partial conformational monoclonal antibody. The correlation coefficient factor r of our reagent and Roche’s was 0.930 9. This study established a screening method for CK-MB partial conformational specific monoclonal antibody, and these monoclonal antibodies were analyzed and an established quantitative detection assay was developed. The new assay had a high concordance with Roche’s.

creatine kinase isoenzyme MB, acute myocardial infarction (AMI), monoclonal antibodies, conformational monoclonal antibodies, capture method

Shengxiang Ge. Tel/Fax: +86-592-6536555; E-mail: sxge@xmu.edu.cn

10.13345/j.cjb.160216

Received: May 31, 2016; Accepted: November 24, 2016

Supported by: Xiamen Science and Technology Program (No. 3502Z20126007).

廈門市科技計(jì)劃 (No. 3502Z20126007) 資助。

時間：2016-12-09

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20161209.1525.001.html

陳自敏, 周國梁, 徐偉玲, 等. CK-MB特異性單抗的制備方法及其應(yīng)用. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(1): 141–150.

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