陳永梅 彭春艷 龔興瑞 秦成名

脂氧素受體激動(dòng)劑BML-111對(duì)慢性神經(jīng)病理性疼痛大鼠治療的研究

陳永梅 彭春艷 龔興瑞 秦成名?

目的 觀察脂氧素受體激動(dòng)劑BML-111對(duì)L5/6脊神經(jīng)結(jié)扎術(shù)后大鼠的鎮(zhèn)痛效果。方法 選擇Wistar大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，建立L5/6脊神經(jīng)結(jié)扎動(dòng)物模型。觀察鞘內(nèi)給予不同劑量的BML-111對(duì)機(jī)械痛和熱痛的抑制作用。鞘內(nèi)給予100μg/kg BML-111并檢測(cè)對(duì)患側(cè)脊髓腰膨大部位IL-1β、IL-6、TNF-α含量的影響。結(jié)果 BML-111劑量依賴性抑制對(duì)L5/6脊神經(jīng)結(jié)扎所導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛；其機(jī)械痛和熱痛最大抑制率分別是67%和69%；半數(shù)有效量分別為16μg/kg和22μg/kg。鞘內(nèi)給予100μg/kg BML-111可有效降低患側(cè)脊髓腰膨大部位IL-1β，IL-6，TNF-α含量（P＜0.05）。結(jié)論 脂氧素受體激動(dòng)劑BML-111可有效減輕L5/6脊神經(jīng)結(jié)扎術(shù)后大鼠神經(jīng)病理性疼痛，其機(jī)制可能與抑制脊髓背角炎癥反應(yīng)有關(guān)。

BML-111 L5/6脊神經(jīng)結(jié)扎術(shù) 神經(jīng)病理性疼痛 大鼠

慢性神經(jīng)病理性疼痛是臨床常見疾病，主要表現(xiàn)為局部疼痛過度敏感，包括機(jī)械性和熱痛覺過敏，最終可導(dǎo)致抑郁，工作能力喪失等不良后果［1］。目前臨床治療主要采用阿片類藥物及5羥色胺受體阻斷劑和去甲腎上腺素再攝取抑制劑進(jìn)行治療，但效果并不滿意［2］。而慢性神經(jīng)病理性疼痛的主要機(jī)制是脊髓背角炎癥反應(yīng)，進(jìn)而敏化神經(jīng)元，因此抑制炎癥反應(yīng)對(duì)治療慢性神經(jīng)病理性疼痛具有重要意義［3］。在之前的研究中作者發(fā)現(xiàn)BML-111在體內(nèi)具有重要的抗炎作用［4-5］。2015年4月至10月作者通過實(shí)驗(yàn)研究，觀察脂氧素受體激動(dòng)劑BML-111對(duì)慢性神經(jīng)病理性疼痛大鼠的作用，并初步分析其可能機(jī)制。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇健康雄性Wistar大鼠，由湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，試驗(yàn)時(shí)遵守NIH動(dòng)物保護(hù)條例。所有大鼠自由進(jìn)食水，光照和黑夜比為12h：12h（每天早晨8點(diǎn)開燈）。IL-1β，IL-6，TNF-α用ELISA 試劑盒購自南京建成生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）實(shí)驗(yàn)分組與模型建立：將5mg氟哌利多與100ml水合氯醛混合，按照3ml/100g的劑量對(duì)大鼠行腹腔注射麻醉，動(dòng)物麻醉后將其固定于手術(shù)臺(tái)上，術(shù)中持續(xù)面罩給氧。按照文獻(xiàn)介紹的方法建立脊神經(jīng)結(jié)扎模型［6］，將大鼠背部毛發(fā)剃除后，噴灑酒精消毒，正中切開腰骶部皮膚，將PE10號(hào)管置入鞘內(nèi)，從頸部皮膚穿出后固定于頸部，方便給藥。分離椎旁筋膜，暴露椎板后將L5椎板下部剪除，可見L5脊神經(jīng)位于偏內(nèi)側(cè)，從骶骨邊緣處勾出L6脊神經(jīng)，將L5、6脊神經(jīng)結(jié)扎?？p合筋膜、皮膚，將大鼠放回籠中飼養(yǎng)。模型建立后2周將大鼠取出測(cè)量其基礎(chǔ)閾值，患側(cè)基礎(chǔ)值＜10g且無對(duì)側(cè)異常痛覺過敏現(xiàn)象。向大鼠鞘內(nèi)注射2%利多卡因10μl，如大鼠未出現(xiàn)雙后肢癱瘓，則排除。假手術(shù)組只切開皮膚，分離筋膜，暴露但不結(jié)扎神經(jīng)。將符合條件的大鼠隨機(jī)分入各實(shí)驗(yàn)組，每組各6只，分別鞘內(nèi)給予生理鹽水1、10、30、100、300μl/kg，觀察其最大鎮(zhèn)痛效果，并計(jì)算其疼痛最大抑制率。（2）行為學(xué)檢測(cè)：機(jī)械痛測(cè)量時(shí)將動(dòng)物放于網(wǎng)狀支架上，長方形塑料盒內(nèi)，適應(yīng)15min后開始測(cè)量，將機(jī)械痛測(cè)量儀（IITC Life Science Inc，CA，USA）鈍頭以緩慢相同力量刺激患側(cè)及健側(cè)，如出現(xiàn)快速的縮足反應(yīng)，則將當(dāng)時(shí)顯示器上的數(shù)值記錄為縮足閾值，測(cè)量3次求其平均值。熱痛測(cè)量時(shí)將大鼠放于透明玻璃上方的長方形塑料盒內(nèi)，適應(yīng)15min，將儀器發(fā)射的熱光源分別照射大鼠雙側(cè)足底，記錄出現(xiàn)縮足反射時(shí)的閾值，并測(cè)量3次求平均值。（3）IL-1β、IL-6、TNF-α含量的測(cè)定：將100μg/kg BML-111注射大鼠鞘內(nèi)，并用15μl生理鹽水沖洗，保證藥物進(jìn)入鞘內(nèi)。2h后處死大鼠，將腰膨大部位的脊髓分離并取患側(cè)，分離筋膜并用生理鹽水沖洗干凈，加入生理鹽水磨碎，離心后取上清液，根據(jù)說明書用ELISA法測(cè)量肺組織勻漿IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad軟件，統(tǒng)計(jì)方法選擇單因素方差分析，最大抑制率（%，MPE）=（患側(cè)最大值-患側(cè)基礎(chǔ)值）/（對(duì)側(cè)值-患側(cè)基礎(chǔ)值），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

鞘內(nèi)注射BML-111劑量依賴性抑制L5、6脊神經(jīng)結(jié)扎術(shù)后神經(jīng)病理性疼痛，藥物達(dá)峰時(shí)間位于鞘內(nèi)注射后約2h，注射8h后鎮(zhèn)痛作用基本消除，BML-111對(duì)機(jī)械痛的最大抑制率為67%，半數(shù)有效量（ED50）為16μg/kg；對(duì)熱痛的最大抑制率為69%，半數(shù)有效量（ED50）為22μg/kg。ELISA檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比假手術(shù)組，脊神經(jīng)結(jié)扎增加IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)（P＜0.05），而給予BML-111可有效降低其含量（P＜0.05），而給予生理鹽水不影響IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。見圖1-2。

圖1 BML-111劑量依賴性抑制脊神經(jīng)結(jié)扎后大鼠的機(jī)械痛（A）和熱痛（B），及機(jī)械痛（C）和熱痛（D）量效曲線

圖2 鞘內(nèi)注射100μg/kg BML-111后2h脊髓患側(cè)IL-1β（A），IL-6（B），TNF-α（C）表達(dá)情況。（A、B分別表示與假手術(shù)組和脊神經(jīng)結(jié)扎組比較：P＜0.05）

3 討論

慢性神經(jīng)病理性疼痛是一種脊髓慢性炎癥性疾病，其脊髓背角炎癥因子升高可敏化脊髓神經(jīng)元導(dǎo)致痛覺過敏，從而導(dǎo)致慢性疼痛。其炎癥因子來源主要為脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，其被激活后釋放一系列炎癥因子。本資料結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，脊神經(jīng)結(jié)扎后IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明神經(jīng)病理性疼痛大鼠患側(cè)脊髓背角存在明顯的炎癥反應(yīng)。

脂氧素是重要的促進(jìn)炎癥消退的物質(zhì)，減少炎癥介質(zhì)的局部濃度。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)給予BML-111劑量依賴性抑制由脊神經(jīng)結(jié)扎所誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛，其效果確切，最大疼痛抑制率達(dá)70%左右。鞘內(nèi)注射后可有效降低同側(cè)IL-1β，IL-6，TNF-α的含量，因此作者推測(cè)其鎮(zhèn)痛作用主要與抑制炎癥反應(yīng)，降低炎癥因子含量有關(guān)。在以往的試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)激活脂氧素受體可有效抑制IL-6，TNF-α炎癥因子的分泌，且可增加體內(nèi)IL-10的含量，從而發(fā)揮其抗炎效果［7-9］。且最近一篇報(bào)道顯示鞘內(nèi)直接脂氧素A4注射也發(fā)現(xiàn)有明顯的抑制疼痛作用，且其鎮(zhèn)痛機(jī)制與抑制TNF-α釋放有關(guān)［10］。由于慢性神經(jīng)病理性疼痛中炎癥因子的產(chǎn)生主要是小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞［11］，因此BML-111可能主要作用于小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞［12］。其作用機(jī)制可能抑制與PI3-K、p38和p42/44 MAPK、NF-kB和AP-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)［13］。但由于脂氧素半衰期較短，因此實(shí)驗(yàn)中采用脂氧素受體激動(dòng)劑BML-111鞘注射，產(chǎn)生明顯抑制炎癥因子釋放的作用，產(chǎn)生效果類似。

神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生后，炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α明顯升高，其主要來自于神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞，因此在實(shí)驗(yàn)中被用作慢性神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生后脊髓炎癥因子的標(biāo)志［14］。慢性神經(jīng)病理性疼痛傳統(tǒng)仍較多使用阿片類藥物治療，但容易產(chǎn)生耐受，呼吸抑制等問題，且長期使用后可導(dǎo)致疼痛敏感化，因此臨床療效受到質(zhì)疑［15］。在本資料中，根據(jù)慢性神經(jīng)病理性主要是病理特征炎癥導(dǎo)致的疼痛敏化，采用促進(jìn)自身機(jī)體炎癥反應(yīng)消退的方法抑制神經(jīng)病理性疼痛，這種方法具有較好的應(yīng)用前景，且克服阿片類藥物的副作用。

總之采用BML-111鞘內(nèi)單次注射可有效抑制神經(jīng)病理性疼痛，成本較低，成功率高，具有較好的應(yīng)用前景。作者將進(jìn)一步明確BML-111作用于膠質(zhì)細(xì)胞信號(hào)通路，進(jìn)而為臨床使用此藥物治療神經(jīng)病理性疼痛提供參考。

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Objective To test the effect of BML-111 on neuropathic pain induced by L5/6 spinal nerve ligation. Methods Wistar rats were used for establishment of rats L5/6 spinal nerve ligation model. Mechanical paw withdrawal threshold and thermal paw withdrawal threshold were measured after intrathecal injection of different dose BML-111. Two hours after the intrathecal injection of 100ug/kg BML-111，the rats ipsilateral spinal cord lumbar enlargement were acquired and measured for IL-1β，IL-6，TNF-α. Results BML-111 dose dependently suppressed neuropathic pain behavior with maximum possible effect（67%）and ED50（16μg/kg）for mechanical stimulation；69% and 22μg/kg for thermal stimulation. 100μg/ kg BML-111 reduced IL-1β，IL-6，TNF-α concentration in ipsilateral spinal cord（P＜0.05）. Conclusions BML-111 dose dependently suppressed neuropathic pain behavior，the reason may be attribute to the reduction of the infl ammatory mediators production.

BML-111 L5/6 spinal nerve ligation Neuropathic pain Rats

湖北省十堰市科技局指導(dǎo)項(xiàng)目（ZD20111016）

442000 湖北省十堰市太和醫(yī)院

*通信作者