姜金融， 薛林貴*， 尚 海 ， 馬 萍， Erhunmwunsee Famous， 褚可成

(1.蘭州交通大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅省環(huán)境監(jiān)測中心站，甘肅 蘭州 730020)

空氣微生物是城市生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，已知存在于空氣中的細(xì)菌及放線菌約有1 200種、真菌40 000種，其組成濃度不穩(wěn)定，種類多樣，主要來源于土壤、水體、動植物、人體以及污水處理、動物飼養(yǎng)等各種生產(chǎn)活動[1-2]?？諝馕⑸锱c生態(tài)平衡及許多生命現(xiàn)象直接相關(guān)，在自然界的物質(zhì)循環(huán)中起著非常重要的作用[3]。目前，對于城市空氣微生物的研究主要集中在濃度粒徑分布特征、群落結(jié)構(gòu)及對人群健康風(fēng)險評價等方面[4-6]，而針對城市生態(tài)系統(tǒng)中空氣微生物群落代謝功能多樣性及其與環(huán)境因子的相關(guān)性研究較少。Biolog微平板可同時測定微生物群落對不同單一碳源的利用能力，通過微生物代謝指紋多維表征微生物群落總體活性、碳代謝功能多樣性信息，Biolog技術(shù)已廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物群落的研究。本研究采用Biolog-ECO技術(shù)和RDA分析對蘭州市不同功能區(qū)空氣微生物群落代謝功能多樣性進行研究，比較分析不同功能區(qū)微生物群落代謝差異及其與環(huán)境因子的相關(guān)性，以期為準(zhǔn)確了解城市空氣微生物群落與生態(tài)功能奠定基礎(chǔ)，為空氣微生物對人們健康、空氣環(huán)境質(zhì)量影響評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究地點

選取蘭州市4個不同功能區(qū)：風(fēng)景區(qū)(Scenic Area，SA)、交通干線(Main Traffic Line，MTL)、公共服務(wù)區(qū)(Public Service Area，PSA)和文教區(qū)(Culture and Education Area, CEA)，分別以興隆山、蘭州火車站、省醫(yī)院、蘭州交通大學(xué)為監(jiān)測點。興隆山是旅游風(fēng)景區(qū)，周邊基本沒有建筑，人流量較小，無車輛通行，綠化率大于95%；蘭州火車站是主要交通干線，周邊有酒店、銀行、商貿(mào)城等建筑，人口及車流量較大，綠化率基本為零；省醫(yī)院是人流來往頻繁的公共場所，周邊有居民樓、研究所，車流量一般，綠化率較??；蘭州交通大學(xué)是文教區(qū)，周邊有圖書館、寢室樓、教學(xué)樓等，上下課時間人流量較大，車流量較少，綠化率約40%。

1.2 樣品采集

使用液體撞擊式空氣微生物采樣器進行空氣樣品的采集， 采樣時間為2016年4月中旬，每個監(jiān)測點分別于9:00、13:00和17:00取樣3次，每次2個重復(fù)。每次空氣樣品采樣流量為12.5 L/min，采樣時間1 h，采集于15 mL PBS緩沖液中，避光4 ℃保存。采樣期間利用AR866風(fēng)速儀測定風(fēng)速，利用TES1360A溫濕度計測定環(huán)境溫度濕度，利用UV-B型紫外輻照計測定UVB強度(表1)。

表1 采樣點環(huán)境因子

1.3 基于Biolog-ECO 板的操作

應(yīng)用Biolog-ECO板解析蘭州市空氣微生物群落代謝功能多樣性。每個監(jiān)測點每天的采樣液混合均勻后分別用八道加樣槍接種至ECO板中，接種量為150 μL/孔，將接種好的微平板放入30 ℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)，每隔24 h用Biolog儀測定590 nm和750 nm下的光密度值，連續(xù)測定10 d。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

微生物群落碳源代謝活性用平均顏色變化率[7](Average well color development， AWCD)表示：

AWCD=Σ(Ci-R)/n

式中：Ci為每個有培養(yǎng)基孔的光密度值；R為對照孔的光密度值；n為培養(yǎng)基碳源種類，本研究中為31。

選取培養(yǎng)192 h后的Biolog數(shù)據(jù)進行主成分分析(PCA)，功能多樣性指數(shù)及不同碳源利用率的計算。Shannon指數(shù)(H′)可評估群落物種的豐富度，McIntosh指數(shù)(U)用于反映群落物種的均一度[8]：

H′=-Σ(Pi·lnPi)

式中：Pi為有培養(yǎng)基的孔和對照孔的光密度值差與整板總差的比值，即Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R)，ni=Ci-R，這樣就可以消除在操作及培養(yǎng)過程中對吸光度變化帶來的影響，對變量進行標(biāo)準(zhǔn)化。

Simpson指數(shù)(D)[9-10]又稱優(yōu)勢度指數(shù)，用于評估最常見種的優(yōu)勢度，是對碳源利用多樣性方面的表達(dá)，但其更加側(cè)重對差異性的描述。Simpson指數(shù)(D)：

D=1-∑Pi2

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析應(yīng)用Excel 2007軟件，Origin 8.5完成相關(guān)繪圖；PCA分析及單因子方差分析(one-way ANOVA)應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行；RDA分析應(yīng)用Canoco軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 空氣微生物群落碳源代謝活性變化

平均顏色變化率(AWCD)從代謝水平上揭示微生物群落功能多樣性，可反映空氣微生物群落對31種碳源總體的利用強度。圖1是蘭州市不同功能區(qū)空氣微生物AWCD值變化情況，隨著培養(yǎng)時間的延長，不同功能區(qū)空氣微生物對碳源的利用量呈逐漸增加趨勢，并具有顯著的空間差異(P<0.01)。具體表現(xiàn)：培養(yǎng)24 h后不同功能區(qū)的AWCD開始出現(xiàn)較大分化，192 h時進入穩(wěn)定期，SA和PSA的碳源代謝活性明顯高于MTL和CEA(P<0.01)，SA與PSA存在顯著差異(P<0.01)，對碳源總體的利用能力呈現(xiàn)SA>PSA>CEA≈MTL的趨勢。

圖1 不同功能區(qū)空氣微生物AWCD變化Fig.1 Average well color development changes of airborne microbes in different function regions

2.2 空氣微生物利用不同類型碳源的特征差異

蘭州市不同功能區(qū)空氣微生物對6大類碳源(糖類7種、氨基酸類6種、酯類4種醇類3種、胺類3種、酸類8種)的相對利用率如圖2所示，SA和PSA空氣微生物對不同碳源的利用率高于其他兩個功能區(qū)，方差分析表明不同功能區(qū)空氣微生物對6類碳源的利用均存在顯著差異(P<0.01)。蘭州市空氣微生物以利用酯類、氨基酸類及醇類為主，其中對酯類的利用強度SA最高，PSA次之，兩者無顯著差異(P>0.05)，但均顯著高于MTL和CEA(P<0.01)。空氣微生物對胺類代謝水平最低，且不同功能區(qū)間差異顯著(P<0.01)。同一功能區(qū)對不同碳源的利用也存在差異。

圖2 不同功能區(qū)空氣微生物對不同碳源的相對利用率Fig.2 Relative utilization ratio of different carbon sources by airborne microbes in different function regions不同字母表示同類型碳源在不同功能區(qū)間差異顯著(P<0.05)Different letters for the same carbon source meant very significant difference among different function regions at 0.05 level

2.3 空氣微生物群落功能多樣性分析

不同功能區(qū)空氣微生物多樣性指數(shù)見表2，分析表明：各多樣性指數(shù)均具有顯著的空間差異(P<0.05)，SA的Shannon指數(shù)，McIntosh指數(shù)明顯高于其他三個功能區(qū)(P<0.01)，說明SA空氣微生物物種豐度及均一度最大，其次是PSA，MTL最低；對于Simpson指數(shù)而言，SA和PSA較高，顯著高于MTL和CEA(P<0.01)，SA空氣微生物常見物種的優(yōu)勢度最高，CEA最低。

表2 空氣微生物功能多樣性指數(shù)的空間變化

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.4 空氣微生物群落代謝功能主成分分析

利用主成分(PCA)分析法分析蘭州市不同功能區(qū)空氣微生物群落代謝功能(圖3)，主成分1(PC1)貢獻率為56.839%，主成分2(PC2)貢獻率為33.107%，兩者累計貢獻率為89.946%，已達(dá)到85%以上，不需要再增加主成分。PC1中載荷大于0.9的基質(zhì)有10種，包括氨基酸類(3種)、酸類(2種)、酯類(2種)、糖類(1種)、胺類(1種)、醇類(1種)；PC2中載荷大于0.9的基質(zhì)6種，包括酸類(3種)、糖類(1種)、醇類(1種)、胺類(1種)(表3)。分析表明，蘭州市空氣微生物碳源利用方式存在顯著的區(qū)域性差異(P<0.01)，按碳源利用相似性可分為三類，其中，MTL和CEA的代謝類群散點較接近，兩者無顯著差異(P>0.05)可歸為一類；SA、PSA類群散點均與MTL和CEA的散點距離較大(P<0.01)，且這兩區(qū)域間代謝功能也存在顯著差異(P<0.05)，因此，MTL歸為一類，PSA歸為一類。與主成分顯著相關(guān)的主要基質(zhì)類型與空氣微生物利用率較高的碳源類型一致，PC1中載荷較大的基質(zhì)是導(dǎo)致蘭州市空氣微生物群落代謝功能區(qū)域性差異的主要分異類型。

圖3 不同功能區(qū)空氣微生物碳源利用的主成分分析Fig.3 Principal component analysis ( PCA) of carbon utilization profiles of airborne microbes in different function regions

類型基質(zhì)主成分PC1(r)PC2(r)糖類肝糖0.91α-D-乳糖0.921氨基酸類L-苯基丙氨酸0.929L-絲氨酸0.976甘氨酰-L-谷氨0.939酯類吐溫-400.934吐溫-800.941醇類D,L-α-甘油0.957I-赤藻糖醇0.936胺類N-乙?；?D-葡萄胺0.959腐胺0.931酸類D-氨基葡萄糖酸0.952D-蘋果酸0.9392-羥苯甲酸-0.9244-羥基苯甲酸0.942衣康酸0.949

2.5 空氣微生物群落功能多樣性的空間差異與環(huán)境因子的相關(guān)性

研究表明，空氣微生物群落功能多樣性與環(huán)境因子具有一定的相關(guān)性[11-12]。蘭州市不同功能區(qū)空氣微生物群落功能多樣性(碳源代謝水平和功能多樣性指數(shù))與環(huán)境因子之間的關(guān)系如圖4所示，從排序結(jié)果可以看出不同功能區(qū)空氣微生物功能多樣性差異明顯，PSA和SA位于第一排序軸的正端，而MTL和CEA位于負(fù)端；PSA和MTL位于第二排序軸的正端，SEA和SA位于負(fù)端。第一排序軸與風(fēng)速(0.895 3)、濕度(0.402 1)呈正相關(guān)，與溫度(-0.626 6)、UVB(-0.253 3)呈負(fù)相關(guān)；第二排序軸與溫度(0.768 7)、UVB(0.549 9)呈正相關(guān)，與風(fēng)速(-0.419 6)、濕度(-0.271 2)呈負(fù)相關(guān)。Shannon指數(shù)、McIntosh指數(shù)、Simpson指數(shù)分別與風(fēng)速(r=0.862、r=0.855、r=0.775)，濕度(r=0.356、r=0.356、r=0.465)呈正相關(guān)；與溫度(r=-0.572、r=-0.56、r=-0.428)，UVB(r=-0.193、r=-0.187、r=-0.241)呈負(fù)相關(guān)。綜合分析，蘭州市不同功能區(qū)空氣微生物功能多樣性具有顯著差異，溫度和風(fēng)速是導(dǎo)致空氣微生物功能多樣性空間差異的主要影響因子。

圖4 空氣微生物功能多樣性的空間差異與環(huán)境因子的RDA分析Fig.4 Redundancy analysis (RDA) of spatial variation of carbon metabolic function of airborne microbes with environmental factors

3 討 論

Biolog ECO微平板主要用于微生物特性及群落的分析研究，通過微生物群落對不同碳源的利用能力來表征其代謝功能多樣性，可反映不同時間或空間尺度上的差異性[13-14]。微平板對接種的微生物樣品有一定的濃度和活性要求，本研究利用液體撞擊式空氣微生物采樣器進行空氣樣品的采集，可有效保持樣品采集的全面性及微生物的生理活性[15]。研究發(fā)現(xiàn)，蘭州市不同功能區(qū)空氣微生物的碳源總體利用強度和多樣性指數(shù)均存在顯著差異(圖1、表2)。其中，SA的碳源總體利用能力、多樣性指數(shù)最高，可能是由于該地區(qū)植被豐富、環(huán)境濕潤為空氣微生物的存在生長提供了良好的環(huán)境，導(dǎo)致該功能區(qū)空氣微生物碳代謝活性高，具有較高的物種豐度和均勻度，這與吳等等等[11]的研究結(jié)果一致；MTL最低，該地區(qū)受人流及其他外界因素干擾較大，空氣中大量存在一些抗逆性較強的微生物(如芽胞桿菌等)，導(dǎo)致碳代謝能力降低[16]。不同功能區(qū)McIntosh指數(shù)差異明顯，SA和PSA較高，說明兩地區(qū)空氣微生物群落較均一，存在相對穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)，而MTL和CEA受外界因素干擾大，均一度較低。

蘭州市四個功能區(qū)空氣微生物碳源代謝優(yōu)勢群落主要為酯類、氨基酸類及醇類利用類型，主成分分析發(fā)現(xiàn)氨基酸類是導(dǎo)致蘭州市空氣微生物群落代謝功能區(qū)域性差異的主要分異類型。吳等等等[11]研究發(fā)現(xiàn)羧酸類是青島市空氣微生物碳源代謝差異的主要分異類型，以上研究結(jié)果與本研究存在差異，這是由于不同地域或不同環(huán)境因子會導(dǎo)致空氣微生物碳代謝特征的區(qū)域性變化，說明空氣微生物群落代謝功能與其所處的生境環(huán)境因子密切相關(guān)。RDA分析發(fā)現(xiàn)，蘭州市不同功能區(qū)空氣微生物群落功能多樣性與環(huán)境因子之間有較好相關(guān)性，其中溫度和風(fēng)速與碳代謝水平及功能多樣性指數(shù)呈現(xiàn)較大相關(guān)性，適宜的溫度能夠保持微生物的生理活性[17]而風(fēng)速會影響空氣微生物的群落組成及濃度變化[18]，溫度、風(fēng)速是導(dǎo)致蘭州市空氣微生物功能多樣性空間差異的主要影響因子。

Biolog ECO 微平板通過呈現(xiàn)不同的多維數(shù)據(jù)來表征微生物群落的代謝功能多樣性，是研究環(huán)境微生物多樣性的主流方法之一[19]。但由于空氣微生物組成多變，群落結(jié)構(gòu)與功能多樣性關(guān)系復(fù)雜，Biolog 方法只能通過測定微生物對不同碳源利用程度的差異來表征其功能多樣性，今后應(yīng)該結(jié)合分子生物學(xué)方法，為準(zhǔn)確了解城市空氣微生物多樣性及其生態(tài)功能提供有效途徑。

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