喻 嬌， 馮乃憲， 喻樂意， 莫測(cè)輝

(暨南大學(xué) 環(huán)境學(xué)院 廣東省環(huán)境污染控制與修復(fù)材料工程中心，廣東 廣州 510632)

抗生素是一類具有干擾、殺死微生物或生活細(xì)胞的有機(jī)化學(xué)物質(zhì)，主要是由微生物(細(xì)菌、真菌和放線菌)在其生長(zhǎng)代謝活動(dòng)中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，也可以通過化學(xué)方法人工合成[1]。抗生素在臨床醫(yī)療和畜牧養(yǎng)殖等方面被廣泛應(yīng)用(表1)。抗生素在生物體內(nèi)停留時(shí)間短、代謝效率低，有60%～90%的抗生素以藥物原形或其代謝物隨糞尿排出[2]。目前大多數(shù)養(yǎng)殖場(chǎng)糞尿和醫(yī)院廢水處理率較低，導(dǎo)致大量含有抗生素的廢水、畜禽糞便和垃圾堆肥的滲濾液以污灌或糞肥形式直接進(jìn)入土壤，導(dǎo)致抗生素在土壤環(huán)境中普遍被檢出?？股夭粩噙M(jìn)入土壤環(huán)境，被土壤顆粒吸附并累積，土壤成為抗生素主要的一個(gè)“匯”?？股卦谕寥乐蟹e累，改變土壤結(jié)構(gòu)和生態(tài)功能，使土壤微生物區(qū)系發(fā)生變化，破壞微生態(tài)平衡，誘導(dǎo)耐藥菌產(chǎn)生并最終導(dǎo)致土壤耕作力下降，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率降低[3]。殘留在土壤中的抗生素被農(nóng)作物吸收和累積進(jìn)入食物鏈，對(duì)動(dòng)物和人類健康構(gòu)成威脅[4]。針對(duì)抗生素污染這一環(huán)境領(lǐng)域關(guān)切的熱點(diǎn)問題，本文在概述土壤環(huán)境中抗生素污染現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)介紹了抗生素對(duì)微生物的影響以及微生物去除抗生素污染的作用，最后提出了土壤抗生素污染研究中存在的問題和今后研究方向，期望為深入研究治理土壤抗生素污染，改善我國土壤抗生素污染現(xiàn)狀，降低生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供參考。

表1 常見的抗生素類型

1 土壤環(huán)境中典型抗生素污染現(xiàn)狀

自1981年從施用雞糞的土壤中檢測(cè)出氯四環(huán)素后，多種抗生素從土壤中被相繼檢出，如磺胺類和喹諾酮類抗生素[4]，濃度范圍為μg/kg至mg/kg。德國[5]、加拿大[6]等發(fā)達(dá)國家在過去十幾年先后從土壤中檢測(cè)出多種抗生素。近幾年，一些發(fā)展中國家也相繼從土壤中檢測(cè)出抗生素，如馬來西亞土壤中磺胺嘧啶的濃度為12～5 773 μg/kg，強(qiáng)力霉素的最高濃度達(dá)到78 516 μg/kg[7]；巴西畜禽養(yǎng)殖附近土壤中恩諾沙星的檢出濃度為22.93 μg/kg[8]。與國外相比，我國土壤中抗生素殘留情況也不容樂觀，尤其是經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)檢出率更高。目前我國對(duì)于抗生素污染調(diào)查主要集中在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的北京、天津、“長(zhǎng)三角”、“珠三角”以及設(shè)施農(nóng)業(yè)發(fā)展較快的山東地區(qū)(圖1a)。通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有機(jī)肥中抗生素含量遠(yuǎn)高于農(nóng)田土壤中抗生素的含量(圖1b、1c)?？梢?，農(nóng)業(yè)、經(jīng)濟(jì)的發(fā)展程度以及施用有機(jī)肥的情況與土壤抗生素污染具有一定聯(lián)系，有待進(jìn)一步研究。

抗生素主要通過污水灌溉、施肥、堆糞等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)進(jìn)入到土壤環(huán)境。利用污水灌溉的土壤中，抗生素的濃度達(dá)到22 μg/kg，并且隨著距離越靠近出水口，抗生素的檢出濃度越高[19]。施用糞肥的“無公害蔬菜”生產(chǎn)基地土壤中喹諾酮類化合物的檢出率達(dá)到92%以上，總含量為3.97～32.03 μg/kg[20]。利用畜禽糞便堆肥的農(nóng)用土壤中檢測(cè)出磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類等多種類型抗生素，其中磺胺甲惡唑檢出濃度為1.08～3.02 μg/kg，四環(huán)素濃度達(dá)到15.2 mg/kg，氧氟沙星、恩諾沙星濃度分別為335 μg/kg和96.0 μg/kg[21]。在北京11個(gè)大型溫室蔬菜生產(chǎn)基地中的土壤和糞肥樣品中均檢測(cè)出多種抗生素，檢出濃度為四環(huán)素類(102 μg/kg)> 喹諾酮類(86 μg/kg)>磺胺類(1.1 μg/kg)> 大環(huán)類脂類(0.62 μg/kg)[22]。本課題組從珠三角地區(qū)蔬菜土壤中檢測(cè)出四環(huán)素、土霉素、金霉素3種四環(huán)素，磺胺甲惡唑、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶等8種磺胺類和環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星等4種喹諾酮類抗生素，其中喹諾酮類抗生素檢出濃度高達(dá)1 537.4 μg/kg，并且發(fā)現(xiàn)在畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)附近的蔬菜地土壤中抗生素檢出濃度最高[23]。可見，土壤抗生素污染狀況嚴(yán)重，其與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式密切相關(guān)，控制灌溉水源和肥源是有效控制抗生素污染的根本措施。

圖1 我國各地區(qū)農(nóng)田土壤及有機(jī)肥中抗生素含量分布Fig.1 The occurrence of antibiotic residues in soil and organic fertilizer in different regions of ChinaA北京[9-10]，B天津[11]，C上海[12-13]，D吉林[14]，E山東[14-15]，F(xiàn)江蘇[16]，G浙江[14,17]，H1廣州[4]，H2佛山[4,18]，H3惠州[4,18]，H4深圳[18]，H5東莞[4]

2 抗生素殘留對(duì)土壤微生物的影響

2.1 誘導(dǎo)抗性基因

抗生素在土壤中累積，導(dǎo)致土壤微生物對(duì)其產(chǎn)生抗性(表 2)。至今已經(jīng)多種抗性基因如大環(huán)類脂類抗性基因(mph和erm)、頭孢菌素類抗性基因(bla)、氨基糖苷類抗性基因(aph和add)、四環(huán)素類抗性基因(tet)等被頻繁從土壤中檢出[21]，土壤已成為各種抗性基因的蓄積庫。細(xì)菌長(zhǎng)期受到抗生素的選擇壓力，主要通過基因的水平轉(zhuǎn)移經(jīng)過土壤介質(zhì)傳播獲得相應(yīng)的抗性基因[24]?？剐曰蛟谕寥郎鷳B(tài)系統(tǒng)中廣泛存在，通過移動(dòng)遺傳元件在細(xì)菌種群之間發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，如抗性基因利用接合性質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子和基因組島等遺傳元件通過轉(zhuǎn)化、接合和轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式實(shí)現(xiàn)其與土著微生物進(jìn)行交換，將外源基因轉(zhuǎn)化給土著微生物[25]。

表2 微生物對(duì)抗生素的抗性機(jī)制

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)中，污水灌溉和畜禽糞肥施用使得大量抗生素、抗性基因和抗性菌株進(jìn)入農(nóng)田土壤，導(dǎo)致抗性基因在土壤中的被誘導(dǎo)和傳播，對(duì)植物、動(dòng)物或微生物產(chǎn)生一系列潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。在土壤中反復(fù)施加含磺胺類抗生素的糞肥，土壤中磺胺類抗性基因顯著提高[26]。在施用豬糞肥的土壤中檢測(cè)出多種喹諾酮類抗生素抗性基因，他們可能來源于豬糞[27]。利用豬場(chǎng)廢水灌溉農(nóng)田，土壤中抗性基因tetQ、tetZ分別提高了500和9倍[28]。土壤中抗性基因的含量和豐度與相應(yīng)的抗生素含量之間存在聯(lián)系[29]，如養(yǎng)殖場(chǎng)附近或施用豬糞肥土壤中四環(huán)素抗性基因tetM、tetO、tetQ和tetW等的絕對(duì)拷貝數(shù)與相應(yīng)抗生素殘留量存在正相關(guān)[30]，并且發(fā)現(xiàn)畜禽糞便中sulII基因的豐度與相應(yīng)抗生素含量呈正相關(guān)[12]。

農(nóng)田土壤中的抗性基因可能會(huì)在土壤微生物、蔬菜以及畜禽動(dòng)物之間水平轉(zhuǎn)移，并在動(dòng)植物體內(nèi)富集，威脅食品安全，帶來極大的健康風(fēng)險(xiǎn)[31]，如在畜禽類發(fā)酵制品中的益生菌體內(nèi)檢出了四環(huán)素類、鏈霉素類和β-內(nèi)酰胺類抗性基因[32]；在家禽肉、豬肉及香腸制品中也發(fā)現(xiàn)了四環(huán)素類、氨基糖苷類和β-內(nèi)酰胺類抗性基因[33]。同樣，在新鮮蔬菜(如西紅柿、辣椒、黃瓜、胡蘿卜及生菜)[34]及蔬菜沙拉中發(fā)現(xiàn)了多種抗性基因[35]。

2.2 影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是衡量土壤肥力的重要指標(biāo)?？股卦谕寥乐欣鄯e，抑制其靶標(biāo)微生物的繁殖和代謝活動(dòng)，選擇性的誘殺土著微生物或者誘導(dǎo)抗性菌株的產(chǎn)生，其他未受到抑制的微生物能夠獲得大量資源而快速繁殖，改變微生物群落組成和功能，破壞土壤微生態(tài)平衡，影響土壤肥力。

外源添加青霉素對(duì)茶園土壤細(xì)菌、放線菌和真菌都具有一定的抑制作用，低濃度的四環(huán)素顯著抑制細(xì)菌和放線菌的生長(zhǎng)[36]；長(zhǎng)期抗生素暴露下，土壤中細(xì)菌/真菌和G-/G+比例發(fā)生改變，如磺胺嘧啶污染使土壤中細(xì)菌/真菌比例下降[37]，而四環(huán)素或青霉素處理茶園土壤后G-/G+比值升高[36]?？股貙?duì)土壤微生物的影響因抗生素種類、濃度和土壤性質(zhì)的不同有較大差異。研究表明，與四環(huán)素和環(huán)丙沙星相比，磺胺甲惡唑具有較強(qiáng)的生物可利用性，對(duì)土壤微生物影響會(huì)更大[38]。紅霉素輕度污染能顯著抑制氨氧化細(xì)菌的生長(zhǎng)，而中度和高度污染對(duì)土壤氨氧化細(xì)菌有增益作用[39]。在粘土中加入50 mg/kg的三氯生明顯抑制土壤的呼吸作用，在沙質(zhì)土壤中卻沒有類似現(xiàn)象[40]。

土壤中殘留的抗生素不但改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，而且會(huì)抑制土壤呼吸作用，降低微生物對(duì)碳源的利用率，干擾功能微生物參與土壤生態(tài)系統(tǒng)元素循環(huán)，危及土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡。研究發(fā)現(xiàn)磺胺嘧啶、氧四環(huán)素和諾氟沙星3種抗生素對(duì)土壤呼吸的最大抑制率分別為76.8%、20.7%和21.9%，并且高濃度的抗生素對(duì)土壤微生物的硝化作用均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用[41]。外源土霉素和磺胺二甲嘧啶對(duì)土壤活性有機(jī)碳含量產(chǎn)生明顯影響，其中土壤微生物碳和易氧化碳含量呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，而水溶性有機(jī)碳和溶解性有機(jī)碳含量產(chǎn)生積累效應(yīng)[42]。此外，施用含有磺胺嘧啶的糞便作為有機(jī)肥，土壤中參與硝化和反硝化作用的氨氧化古菌豐度和多樣性發(fā)生明顯降低[43]。土壤土霉素污染可抑制土壤氨氧化微生物，改變其微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性，進(jìn)而影響土壤中氮元素的生物地球化學(xué)過程[44]。

目前，應(yīng)用分子技術(shù)研究抗生素對(duì)土壤微生物群落影響的工作已廣泛開展，如利用T-RFLP(末端限制性片斷多樣性)方法研究土霉素對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明土霉素對(duì)茶園土壤細(xì)菌、放線菌和真菌都具有一定的抑制作用，低濃度的四環(huán)素顯著抑制細(xì)菌和放線菌的生長(zhǎng)[45]。但是這些方法不能同時(shí)定性和定量，對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)研究具有一定局限性。宏基因組技術(shù)與傳統(tǒng)分子指紋圖譜技術(shù)相比能夠解析復(fù)雜環(huán)境中微生物群落物種組成和相對(duì)豐度[46]。目前，該技術(shù)主要應(yīng)用于研究抗生素對(duì)水環(huán)境微生物群落影響[47]，而對(duì)于抗生素脅迫下土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)變化鮮有報(bào)道。

3 土壤中抗生素微生物消減方法

3.1 微生物降解

微生物降解是去除土壤中抗生素污染的重要方式。近年來關(guān)于抗生素微生物降解的研究已引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注(表3)。研究發(fā)現(xiàn)磺胺甲惡唑在土壤中易發(fā)生好氧降解，結(jié)果顯示濃度為40 μg/kg的磺胺甲惡唑微生物降解顯著[48]。通過改變土壤養(yǎng)分水平和種植蔬菜等方式提高土壤微生物活性，促進(jìn)土壤中磺胺二甲嘧啶的微生物降解[49]。如施用糞肥能夠增加土壤中有機(jī)質(zhì)含量，促進(jìn)微生物代謝活性和降解能力，加快磺胺類藥物在混合基質(zhì)中的降解速率。微生物降解作用是土壤磺胺類抗生素降解的主要途徑。但是微生物對(duì)抗生素的降解能力表現(xiàn)出很大的差異，Alexy等[50]發(fā)現(xiàn)微生物對(duì)芐青霉素的降解率為27%，阿莫斯林降解率為5%，制霉菌素和甲氧芐氨嘧啶的降解率為4%，其余抗生素的降解率均低于4%。

除自然條件下的微生物降解以外，高效降解菌株的篩選和基因工程菌的研究是微生物處理土壤抗生素污染的主要研究方向。目前，關(guān)于微生物對(duì)抗生素降解的研究主要有喹諾酮類抗生素環(huán)丙沙星和諾氟沙星[51]、四環(huán)素類抗生素[52]、頭孢類抗生素[53]以及磺胺類抗生素[54]等。從抗生素制藥廠、藥渣中篩選出四環(huán)素高效降解酵母菌(TrichosporonmycotoxinivoransXPY-10)、無丙二酸檸檬酸桿菌(Citrobacteramalonaticus)、缺陷短波單胞菌(Brevundimonasdiminuta)等，對(duì)四環(huán)素降解率達(dá)到83%以上[52]；接種土霉素高效降解葡萄球菌(Staphylococcussp. TJ-1)能夠?qū)⒇i糞中土霉素的降解效率提升約20%[55]。另據(jù)報(bào)道，木質(zhì)素分解真菌(Pleurotusostreatus)能夠降解土霉素，并且土霉素的降解產(chǎn)物為2-乙酰-2-去酰胺土霉素[56]。從長(zhǎng)期堆放泰樂菌素藥渣附近土壤中篩選出的越南伯克霍爾德菌(Burkholderiavietnamiensis)能夠有效降解泰樂菌素；同樣來源的無丙二酸檸檬酸桿菌(Citrobacteramalonaticus)也能夠有效降解泰樂菌素[57]。嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillusstearothermophilus)和蒼白桿菌屬(OchrobactrumhaematophilumAW1-12)對(duì)阿維菌素有很強(qiáng)的降解能力[58-59]；郭夏麗等[60]發(fā)現(xiàn)在固定化培養(yǎng)后黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)對(duì)磺胺甲惡唑的去除率達(dá)到100%，其較優(yōu)碳源和氮源分別是葡萄糖和酒石酸銨。由此可見，利用微生物降解消除土壤抗生素污染是可行的。

表3 抗生素的主要降解途徑及降解酶

抗生素微生物降解通常受眾多環(huán)境因素的影響，如溫度、pH、供養(yǎng)情況、生物量等?；钚晕勰嘀胸S富的碳源和氮源能夠影響微生物對(duì)抗生素的降解效果，通過優(yōu)化活性污泥中碳源和氮源配比，針對(duì)不同抗生素篩選培養(yǎng)特異性高效降解菌株加入到活性污泥系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)活性污泥系統(tǒng)溫度，均能夠提高抗生素的降解效果[54]?；钚晕勰嘧鳛閲鴥?nèi)外污水處理重要方式，通過對(duì)活性污泥中抗生素降解菌的研究，去除污水中抗生素殘留，降低污水灌溉對(duì)土壤抗生素污染的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。并且，可以直接利用活性污泥中抗生素降解菌解決土壤抗生素污染問題。

3.2 堆肥降解

堆肥技術(shù)是一種經(jīng)濟(jì)有效的無害化去除畜禽糞便和污泥中抗生素的方法，主要利用微生物活動(dòng)和環(huán)境條件(如水分、含氧量、溫度、pH和堆料C/N等)的共同作用降低糞肥中抗生素的濃度，達(dá)到有效去除土壤中殘留抗生素的目的，對(duì)四環(huán)素類、磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的消除效率可達(dá)50%～70%[62-63]，如堆肥處理可以去除豬糞中70%～92%四環(huán)素類抗生素[64]，雞糞中48.4%～77.1%的氟喹諾酮類抗生素[65]以及污泥中85%以上的四環(huán)素類抗生素[66]，而磺胺嘧啶則可完全降解[67]。通過人為控制堆肥條件，促進(jìn)堆肥中微生物代謝活性，提高微生物體內(nèi)降解酶的降解能力，進(jìn)而加速堆肥中抗生素的去除，如翻堆+機(jī)械通風(fēng)能夠促進(jìn)堆肥腐熟進(jìn)程，提高堆體溫度，可以有效去除豬糞中磺胺二甲嘧啶、土霉素、金霉素和泰妙霉素[68]，較高的初始C/N(25.5～32.8)能夠有效降解雞糞堆肥中土霉素的降解[69]。

添加微生物菌劑也能促進(jìn)堆肥中抗生素的去除，如添加枯草芽胞桿菌和地衣芽胞桿菌混合菌劑，可以提高雞糞堆肥的高溫期溫度，能夠提高土霉素的降解速率[70]。添加高效降解纖維素及金霉素和土霉素的復(fù)合菌劑能夠促進(jìn)雞糞堆肥中金霉素和土霉素的降解[71]；接種外源耐高溫產(chǎn)纖維素酶和蛋白酶菌種可以將喹諾酮類抗生素的去除率提高3.3%～7.2%，且諾氟沙星和洛美沙星的去除率顯著提高[65]。因此，畜禽糞便和污泥堆肥無害化處理有利于減少畜牧養(yǎng)殖業(yè)對(duì)土壤環(huán)境抗生素污染，具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.3 酶降解

通過微生物降解酶去除土壤中抗生素的研究取得了一定進(jìn)展。白腐真菌產(chǎn)生的天然木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶對(duì)四環(huán)素和土霉素的降解效率分別為72.5%和84.3%[72]，其所產(chǎn)生的漆酶對(duì)環(huán)丙沙星的降解率達(dá)到97.7%[51]。番薯鏈霉菌產(chǎn)生的漆酶在堿性條件下可使兩種喹諾酮類抗生素環(huán)丙沙星和諾氟沙星的毒性分別降低90%和70%[73]。利用氯過氧化酶為催化劑，雙氧水為氧化劑對(duì)降解磺胺類抗生素和林可酰胺類抗生素的降解率達(dá)90%以上。谷胱甘肽轉(zhuǎn)S-轉(zhuǎn)移酶可以降低四環(huán)素、磺胺噻唑和氨芐青霉素的微生物毒性[74]。

4 問題與展望

我國作為抗生素消費(fèi)大國，土壤抗生素污染狀況嚴(yán)重?？股貧埩魧?duì)微生物的生態(tài)毒性主要表現(xiàn)在其對(duì)土壤微生物結(jié)構(gòu)功能的影響和誘導(dǎo)抗性基因。由于污水灌溉和畜禽糞肥的施用，使抗生素污染物源源不斷的輸入土壤中，而依靠抗生素在土壤中緩慢自然消減很難在短時(shí)間內(nèi)緩解土壤抗生素污染現(xiàn)狀。尋找抗生素高效降解微生物是解決當(dāng)前土壤抗生素污染問題的重要方法。目前對(duì)土壤抗生素污染微生物去除和修復(fù)的報(bào)道還比較少，目前大都還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，抗生素微生物降解途徑、降解機(jī)制尚不清晰，因此亟需從以下幾個(gè)方面深入研究：①篩選高效降解抗生素的復(fù)合菌系，通過菌株之間的相互協(xié)作，利用共代謝機(jī)制完成對(duì)難降解抗生素的有效去除。目前僅有很少報(bào)道能夠降解環(huán)丙沙星的微生物菌株。本研究組已經(jīng)篩選出多株喹諾酮類抗生素降解菌，發(fā)現(xiàn)多菌株協(xié)作降解喹諾酮類抗生素的效率高于單菌。②對(duì)微生物降解抗生素的關(guān)鍵酶和關(guān)鍵基因進(jìn)行研究，深入研究微生物降解途徑和降解產(chǎn)物。③土壤抗生素污染是多種抗生素共存，研究能夠同時(shí)降解多種抗生素的復(fù)合功能菌株或微生物復(fù)合菌劑并聯(lián)合植物修復(fù)是解決土壤抗生素污染的工作重點(diǎn)。

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