趙軼峰 楊永江 王曉元 梁晚平 李秀娟 黃 迪 高曉斌 魏玉磊

Wnt信號(hào)通路在姜黃素誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡中作用機(jī)制

趙軼峰 楊永江 王曉元 梁晚平 李秀娟 黃 迪 高曉斌 魏玉磊

目的 探討Wnt通路在姜黃素誘導(dǎo)人乳腺癌 MCF-7細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。方法 將MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)液隨機(jī)分為5組，分別加入15、30、60、120 μmol/L的姜黃素，對(duì)照組不加，培養(yǎng) 12，24，48 h 后采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。分A、B兩組(劑量組、時(shí)間組) 采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)(FCM)觀測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期分布；Western Blotting法檢測(cè)A、B兩組的Wnt通路相關(guān)蛋白，并進(jìn)行相應(yīng)的相關(guān)性分析探討Wnt通路與乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的關(guān)系。結(jié)果 CCK-8結(jié)果顯示，隨培養(yǎng)時(shí)間延長，姜黃素各濃度組MCF-7細(xì)胞增殖抑制率逐漸增高(均P<0.05)；在同一時(shí)間點(diǎn)，隨著姜黃素濃度升高，細(xì)胞增殖抑制率逐漸增高(均P<0.05) 。FCM染色結(jié)果顯示，隨著姜黃素濃度增加、作用時(shí)間延長MCF-7細(xì)胞凋亡指數(shù)逐漸上升(均P<0.05)，且G1/S期細(xì)胞增加越多(P<0.05)。Western Blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MCF-7細(xì)胞中Wnt1、β-catenin的表達(dá)下調(diào)程度呈現(xiàn)劑量時(shí)間依賴性 (P<0.05)。相關(guān)性分析顯示細(xì)胞抑制率、G0/G1期細(xì)胞百分比、細(xì)胞凋亡率均與Wnt 通路相關(guān)蛋白Wnt1、β-catenin的表達(dá)呈現(xiàn)較明顯的相關(guān)性(P<0.05)。結(jié)論 姜黃素的抗癌活性與抗增殖能力具有明顯的劑量時(shí)間依賴性，且Wnt通路在姜黃素誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞抑制、凋亡過程中發(fā)揮了重要作用。

Wnt信號(hào)通路;姜黃素;MCF-7細(xì)胞;細(xì)胞凋亡

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:188～191)

姜黃素是提取于天然中草藥中的1種植物多酚，毒性低下，具有廣泛的抗炎、抗氧化、降血脂、抗突變、抗腫瘤的藥理作用。有研究指出姜黃素對(duì)多種腫瘤有明顯的抑制或殺傷作用，且參與人體多條信號(hào)通路的調(diào)控，Wnt 信號(hào)便是重要的一條[1]。經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路(Wnt/β-catenin 通路)由細(xì)胞外的配體(Wnt 家族分子)、細(xì)胞膜的受體(Frizzled家族分子和 LRP-5/6)、胞漿內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白(Dsh、APCAxin、GSK-3β、CK-1、β-catenin 等)及核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控部分(TCF/LEF1 家族)組成[2]，參與了多項(xiàng)生物學(xué)功能的調(diào)控，主要是通過調(diào)節(jié)胞質(zhì)β-catenin的磷酸化與降解進(jìn)行的。正常情況下，大部分β-catenin與 E 鈣黏附蛋白(E-cadherin) 和細(xì)胞骨架蛋白(Actin)結(jié)合，以穩(wěn)定形式存在；只有少部分與細(xì)胞質(zhì)中的APC)、GSK3β 及Axin 結(jié)合形成“降解復(fù)合物”，隨后進(jìn)行降解使胞質(zhì)內(nèi)游離的 β-catenin 維持在低水平，難以進(jìn)入細(xì)胞核。一旦有了Wnt 信號(hào)，可以與跨膜受體 Frizzled 家族分子和 LRP-5/6 結(jié)合，并作用于胞質(zhì)內(nèi)的 Dvl，破壞降解 β-catenin 的多蛋白復(fù)合物，使得非磷酸化 β-cateninβ-catenin 在細(xì)胞質(zhì)的水平得到累積，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，激Wnt 相關(guān)靶基因(C-myc、Cyclin D1等)[3-4]。Wnt 通路的關(guān)鍵是胞漿中是否存在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的、可溶性的β-catenin[5]。Wnt通路的失調(diào)及過度激活與多種癌癥(結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌等)的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。然而目前對(duì)姜黃素在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)作用的精確靶點(diǎn)還不十分清楚。本研究本研究將姜黃素作用于乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞，觀察姜黃素對(duì)乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞的生長及 Wnt 信號(hào)通路的影響，并探討Wnt通路在姜黃素誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡中機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌 MCF-7，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。將細(xì)胞單層接種在DMEM 培養(yǎng)液(購自美國GIBCO公司，含 10%FBS 、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素，無菌過濾)中,在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度長至80%時(shí)對(duì)其用0.25%胰酶及0.02% EDTA將貼壁生長的細(xì)胞用直接吹打法傳代。過夜待其貼壁后,取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 姜黃素配制

姜黃素(試劑純度>95%)，由河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心提供。采用二甲基亞砜(DMSO)進(jìn)行溶解,配制成 1 mmol/L 待用，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱進(jìn)行冷凍保存。試驗(yàn)時(shí)根據(jù)所需的濃度(0、15、30、60、120 μmol/L)將儲(chǔ)存的姜黃素進(jìn)行稀釋，其中不含藥的細(xì)胞培養(yǎng)液組作為空白對(duì)照組。并按所需濃度向人乳腺癌 MCF-7細(xì)胞中加入姜黃素溶液，細(xì)胞處理 12 h、24 h、48 h后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

分為A、B兩組進(jìn)行FCM及Western blot實(shí)驗(yàn)。A組為劑量組,即0、15、30、60、120 μmol/L姜黃素處理24 h;B組為時(shí)間組,即用60 μmol/L姜黃素處理12 h、24 h、48 h。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞抑制率

細(xì)胞活性計(jì)數(shù)試劑盒CCK8 (Cell Counting Kit 8)源自日本。將細(xì)胞培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化離心，并調(diào)整細(xì)胞株密度至8×104個(gè)細(xì)胞/ml，接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，并加入用培液稀釋的0、15、30、60、120 μmol/L姜黃素，每組設(shè)4個(gè)平行孔,100 nl/L每孔，每孔終體積為200 μl。繼續(xù)作用培養(yǎng)24 h、48 h后，照試劑盒說明書更換培養(yǎng)液(加入CCK-8試劑，放在37 ℃培養(yǎng)箱中共同孵育4 h)；分別對(duì)作用24 h、48 h后的培養(yǎng)液用自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長處各孔的吸光度(OD)值，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算細(xì)胞抑制率。并根據(jù)細(xì)胞存活率對(duì)藥物劑量對(duì)數(shù)作圖求出IC50值。

細(xì)胞抑制率=(OD對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組)/OD對(duì)照組×100%

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡及細(xì)胞周期

加姜黃素12 h、24 h、48 h后以0.25%胰蛋白酶消化收集MCF-7細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)(FCM)說明(bender公司)操作,取出295 μl細(xì)胞懸液加入5 μlAnnexin V-FITC混勻并且室溫放置10 min。用PBS洗滌細(xì)胞2次并重新加入290 nl/L的Binding緩沖液以重懸細(xì)胞，并加入10 nl/L 的10 μg/ml的PI (Propidium Iodide)，輕輕混勻，4 ℃避光反應(yīng)15 min，加入200 nl/L預(yù)冷的IX混合緩沖液中，混勻后立即上機(jī)檢測(cè)。使用 guava 微流式細(xì)胞分析儀Nexin程序進(jìn)行細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)，測(cè)定細(xì)胞數(shù)為 10 000個(gè)，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.5 Western Blot 法檢測(cè)蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長期人乳腺癌MCF-7細(xì)胞并接種于6孔培養(yǎng)板，在分別用0、15、30、60、120 μmol/L姜黃素處理細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞后，RIPA裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，配膠，高溫變性。將變性的蛋白以80 μg/30 μL 每孔上樣進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF，5%脫脂牛奶封閉2 h。結(jié)合適當(dāng)濃度的一抗4 ℃冰箱過夜后充分清洗，再分別與對(duì)應(yīng)的 HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，顯色采用eECL法，數(shù)據(jù)采集與分析采用OmegaLum G成像系統(tǒng)。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同濃度姜黃素對(duì)MCF-7 細(xì)胞增殖的影響

15、30、60、120 μmol/L姜黃素在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)

胞抑制率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.080,P=0.036;F=7.358,P=0.027;F=9.636,P=0.001;F=13.441,P≤0.001)，兩兩比較顯示呈明顯時(shí)間依賴性；同一時(shí)間點(diǎn)，15、30、60、120 μmol/L姜黃素的細(xì)胞抑制率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.981,P=0.022;F=10.080,P<0.001;F=14.650,P<0.001)，兩兩比較顯示呈明顯劑量依賴性，見表1。另外，不同濃度姜黃素作用于MCF-7細(xì)胞48 h后，姜黃素生物活性(IC50)測(cè)定為21.6 μmol/L。

表1 不同濃度姜黃素的MCF-7 細(xì)胞抑制率

注：a為與對(duì)照組比較,P<0.05;b為與15 μmol/L比較，P<0.05;c為與30 μmol/L比較,P<0.05;d為與60 μmol/L比較,P<0.05。1為與姜黃素組12 h比較,P<0.05;2為與姜黃素組24 h比較,P<0.05。

2.2 不同濃度姜黃素對(duì) MCF-7 細(xì)胞凋亡的影響

MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)24 h后(A組),0、15、30、60、120μmol/L姜黃素組凋亡率分別為0.87%、5.21%、7.80%、19.45%、30.31%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；細(xì)胞周期分布顯示姜黃素濃度越高G1/S期細(xì)胞增加越多(P<0.001)，見表2。加入60 μmol/L姜黃素培養(yǎng)12 h、24 h、48 h后的凋亡率分別為6.89%、19.45%、22.12%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，顯示姜黃素作用時(shí)間越長使得G1/S期細(xì)胞增多越明顯(P<0.05)。具體結(jié)果見表3。

表2 不同濃度姜黃素對(duì)MCF27細(xì)胞周期和 凋亡率的檢測(cè)結(jié)果/%

注：a為與對(duì)照組比較,P<0.05;b為與15 μmol/L比較，P<0.05;c為與30 μmol/L比較,P<0.05;d為與60 μmol/L比較,P<0.05。

表3 不同作用時(shí)間MCF-7細(xì)胞周期和凋亡情況/%

注：1為與姜黃素組12 h比較,P<0.05;2為與姜黃素組24 h比較,P<0.05。

2.3 姜黃素對(duì)Wnt通路相關(guān)蛋白(Wnt1、β-catenin)表達(dá)的影響

MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)24 h后(A組),0、15、30、60、120 μmol/L姜黃素組的Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá)量的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；加入60 μmol/L姜黃素培養(yǎng)12 h、24 h、48 h后的Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá)量的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。具體見表4。

2.4 Wnt通路相關(guān)蛋白表達(dá)與MCF-7細(xì)胞的抑制、周期及凋亡的相關(guān)性

通過對(duì)A、B兩組的24次的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：細(xì)胞抑制率、G0/G1期細(xì)胞百分比、細(xì)胞凋亡率均與Wnt 通路相關(guān)蛋白Wnt1、β-catenin的表達(dá)呈明顯相關(guān)性(P<0.05)，提示W(wǎng)nt 通路在姜黃素誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞增殖抑制及凋亡過程中具有重要作用。具體見表5。

表4 乳腺癌細(xì)胞中Wnt1、β-catenin的蛋白 表達(dá)量

注：a為與對(duì)照組比較,P<0.05;b為與15μmol/L比較，P<0.05;c為與30 μmol/L比較,P<0.05;d為與60 μmol/L比較,P<0.05。1為與姜黃素組12 h比較,P<0.05。

表5 Wnt通路相關(guān)蛋白表達(dá)與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性(n=24)

3 討論

對(duì)于預(yù)后較差的乳腺癌，多重耐藥與復(fù)發(fā)一直存在，僅依靠外科手術(shù)難以根治，多采取集手術(shù)、化放療、內(nèi)分泌治療、生物治療、物理康復(fù)治療和中醫(yī)中藥治療等多種治療方式于一體的綜合手段，以提高乳腺癌的治愈率及生存率。因此，積極探索新的治療領(lǐng)域是乳腺癌治療研究的熱點(diǎn)，包括中醫(yī)藥治療。既往大量細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證明，姜黃素具明顯的抗突變、抗腫瘤的生物活性，且抗癌譜較廣、毒副作用小,應(yīng)用前景廣泛[6]。Wnt信號(hào)是一參與人體細(xì)胞多種復(fù)雜的生化反應(yīng)的調(diào)節(jié)通路，近年來許多研究指出其余多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，針對(duì)與乳腺癌等的研究也較多，均指出乳腺癌組織中存在著異常 Wnt通路，導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展[7]。但目前對(duì)于Wnt信號(hào)通路在姜黃素誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡中如何發(fā)揮作用尚待不確切。

本研究中經(jīng)姜黃素作用過的MCF-7細(xì)胞出現(xiàn)了顯著的細(xì)胞抑制及凋亡反應(yīng)，且表現(xiàn)出明顯的劑量與時(shí)間依賴性，作用劑量越大、作用時(shí)間越長，抗癌活性越高，抗增殖能力及殺傷能力就越強(qiáng)。從細(xì)胞周期分布來看,姜黃素使MCF-7細(xì)胞阻滯在G0/S期，無法進(jìn)入下一增殖周期。正常情況下細(xì)胞周期阻滯時(shí)，細(xì)胞能夠通過自我修復(fù)、開啟細(xì)胞凋亡系統(tǒng)，受損細(xì)胞凋亡。而在腫瘤細(xì)胞中無法實(shí)現(xiàn)自我修復(fù)，從而出現(xiàn)細(xì)胞失控、無限增殖的現(xiàn)象。姜黃素是一種可以抑制細(xì)胞的增殖的TPK 抑制劑，且能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生停滯在G0/S期，因而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。這一結(jié)果提示姜黃素抑制細(xì)胞增殖發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制之一是通過影響細(xì)胞周期分布，引起細(xì)胞代謝紊亂,導(dǎo)致細(xì)胞重新分化進(jìn)行的，這與相關(guān)研究結(jié)果一致[8-10]。

Wnt通路的功能障礙異常、Wnt信號(hào)激活或細(xì)胞，導(dǎo)致β-catenin水平失控是腫瘤發(fā)生的重要原因。因此，抗腫瘤是從封閉異?；罨腤nt 信號(hào)通路入手，達(dá)到誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的，甚至已經(jīng)有人嘗試以該通路為靶點(diǎn)來進(jìn)行腫瘤治療嘗試[11]。Wnt1 蛋白是由 Wnt 基因編碼的分泌糖蛋白，是Wnt 通路的組成部分，主要通過其下游的DSH 、β-catenin、APC 等去磷酸化和磷酸化過程來完成 Wnt 信號(hào)傳遞。Wieczorek M 等人就曾通過阻斷Wnt-1 信號(hào)達(dá)到了誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞 MCF-7 細(xì)胞凋亡的目的[12]。β-catenin是Wnt通路的經(jīng)典信號(hào)，可進(jìn)入細(xì)胞核并堆積在核內(nèi)，引起腫瘤的發(fā)生。本研究姜黃素作用于 MCF-7 細(xì)胞24 h后，Wnt1、β-catenin隨著姜黃素劑量的增加其蛋白表達(dá)量越低；同在60 um/L姜黃素作用12 h、24 h、48 h的Wnt1、β-catenin的蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。提示姜黃素抑制乳腺癌細(xì)胞增殖抑制與凋亡可能與Wnt通路的調(diào)控有關(guān)。進(jìn)一步的相關(guān)性分析顯示細(xì)胞抑制率、細(xì)胞周期分布、細(xì)胞凋亡均與Wnt1、β-catenin的表達(dá)呈現(xiàn)較明顯的相關(guān)性(P<0.05)。因此，本研究的結(jié)果可以說明姜黃素誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞凋亡可能由于影響了經(jīng)典的 Wnt/β-catenin途徑引起的。正常狀態(tài)下細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)游離 β-catenin 濃度處于相對(duì)較低水平，β-catenin失控造成腫瘤發(fā)生。姜黃素后能夠封閉異常活化的Wnt 信號(hào)，有效降低β-catenin 水平及與Wnt相關(guān)的其他蛋白。但是Wnt 基因激活的原因尚不清楚，如果我們想把Wnt 信號(hào)通路與治療靶點(diǎn)聯(lián)系起來，尚缺乏足夠的證據(jù)。且腫瘤細(xì)胞與多條信號(hào)通路交織復(fù)雜，我們還需要考慮各條信號(hào)通路之間的交互作用，展開進(jìn)一步的研究。

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(編輯：吳小紅)

Role of Wnt Signaling Pathway in Curcumin-induced Apoptosis of Breast Cancer Cells MCF-7

ZHAOYifeng,YANGYongjiang,WANGXiaoyuan,etal.

FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity,Zhangjiakou,075061

Objective To investigate the mechanism of Wnt pathway in curcumin-induced apoptosis of human breast cancer cells MCF-7.Methods The MCF-7 cells were randomly divided into 5 groups,respectively received 15,30,60 and 120μmol/L curcumin,and the control group,CCK-8 cells were cultured for 12,24 and 48 hours to detect proliferative capacity.Apoptosis and cell cycle distribution were observed by Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry (FCM).The Wnt pathway of group A and group B was detected by western blotting method.And to explore the relationship between the Wnt pathway and the apoptosis of breast cancer MCF-7 cells.Results CCK-8 showed that the proliferation inhibition rate of MCF-7 cells increased gradually with the increase of curcumin concentration (P<0.05);at the same time point,with the increase of curcumin concentration,the inhibition of cell proliferation (P<0.05).FCM staining showed that the apoptotic index of MCF-7 cells increased gradually with the increase of curcumin concentration (P<0.05) and the increase of G1/S phase cells (P<0.05).Western blotting results showed that the expression of Wnt1 and β-catenin in MCF-7 cells was dose and time dependent (P<0.05).The correlation analysis showed that the percentage of cells,G0/G1phase, apoptosis rate were closely correlated with the expression of Wnt1 and β-catenin (P<0.05).Conclusion The anticancer activity and antiproliferative ability of curcumin have a dose and time dependent manner,and Wnt pathway has a significant effect on the expression of Wnt1 and β-catenin in curcumin-induced breast cancer MCF-7 cells,and it plays an important role in the process of apoptosis.

Wnt signaling pathway;Curcumin;MCF-7 cells;Apoptosis

河北省衛(wèi)生廳科研基金項(xiàng)目(編號(hào)：20150468)

075061 河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院

梁晚平

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.02.005

R737.9

A

1001-5930(2017)02-0188-04

2016-12-12

2017-01-12)