劉 靜，張紅英 綜述 張祥宏 審校

赭曲霉毒素A致癌機(jī)制研究進(jìn)展

劉 靜1，張紅英2綜述 張祥宏3審校

赭曲霉毒素A；致癌機(jī)制；氧化應(yīng)激

赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)是一種主要由純綠青霉、碳黑曲霉和赭曲霉產(chǎn)生的真菌毒素，廣泛存在于食品、農(nóng)產(chǎn)品和動物飼料中，因此OTA與人類健康的關(guān)系備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，OTA具有腎毒性、肝毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性和致畸性[1]。國際癌癥研究中心(International Agency for Research on Cancer, IARC)1993年把OTA定為“B級人類可能致癌物”[2]。但是，迄今為止有關(guān)OTA的致癌作用機(jī)制尚不完全清楚。筆者主要就目前備受關(guān)注的OTA致癌機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 OTA致癌性

OTA是嚙齒類動物明確的致癌物。美國國家毒物學(xué)計(jì)劃的一項(xiàng)研究，210、70、21 μg/kg體重OTA喂食F344N大鼠。2年后，210 μg/kg體重劑量組出現(xiàn)了腎管狀腺瘤和癌，其中72%為雄性，16%為雌性。70 μg/kg體重劑量組，39%的雄性大鼠和4%的雌性大鼠出現(xiàn)了腎腺瘤或癌。OTA誘癌有性別差異，雄性較雌性敏感。此外，還觀察到腎臟非新生物形式的病理變化，例如增生、細(xì)胞增殖、胞漿改變和核肥大。腎細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在肝、肺和淋巴結(jié)[3]?；诖?，國際癌癥研究中心將OTA界定為B級人類可能致癌物[2]。德意志研究聯(lián)合會的一個委員會在2003年對工作區(qū)域的化學(xué)物質(zhì)的健康危害進(jìn)行了調(diào)查，根據(jù)OTA的長期的動物實(shí)驗(yàn)研究或流行病學(xué)研究的證據(jù)認(rèn)為OTA具有致癌危險，將OTA分為2類致癌物[4]。

除了腎臟腫瘤外，Schwartz[5]提出了OTA暴露可能與睪丸癌發(fā)生率增高有關(guān)的假說。雖然沒有流行病學(xué)研究支持此假說，但是實(shí)驗(yàn)證明高劑量的OTA引起睪丸癌，并且形成OTA-DNA加合物。乳腺也是OTA的潛在靶目標(biāo)，OTA增高了乳腺纖維腺瘤的發(fā)病率[3]。

2 OTA介導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)

2.1 OTA誘導(dǎo)氧化應(yīng)激

2.1.1 機(jī)制 ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激及大分子物質(zhì)損傷被認(rèn)為是衰老及包括腫瘤在內(nèi)的慢性疾病的發(fā)病機(jī)制之一[6, 7]。一些研究結(jié)果顯示，OTA引發(fā)ROS生成，通過各種直接和間接的機(jī)制導(dǎo)致氧化應(yīng)激。

還原系統(tǒng)由磷脂囊泡、NADPH氧化酶、細(xì)胞色素P450還原酶和Fe3+組成，OTA可以螯合Fe3+從而減少其還原為Fe2+，在氧存在的情況下，F(xiàn)e2+提供活性成分開始脂質(zhì)過氧化[8]。一些學(xué)者報(bào)道，OTA氫醌/苯醌對由OTA氧化產(chǎn)生，苯醌是半醌和氫醌減少的結(jié)果。這些導(dǎo)致氧化還原循環(huán)和活性氧的產(chǎn)生。雖然給予OTA處理可以使體外培養(yǎng)的細(xì)胞形成苯醌[9]，但是體內(nèi)環(huán)境對于這些反應(yīng)的生理變化的真正關(guān)聯(lián)還沒有得以明確。

遺傳毒理學(xué)研究為OTA介導(dǎo)的氧化損傷機(jī)制的研究提供了又一有力證據(jù)。OTA明顯降低腎組織中參與氧化應(yīng)激的基因的表達(dá)，其中許多基因的啟動子區(qū)包含抗氧化調(diào)控元件?？寡趸{(diào)控元件被Nrf2所識別，Nrf2參與編碼解毒、細(xì)胞保護(hù)、抗氧化酶的基因的基礎(chǔ)表達(dá)和誘導(dǎo)[10]。這些發(fā)現(xiàn)引發(fā)了如下假說，即OTA削弱了細(xì)胞的抗氧化防御屏障從而使細(xì)胞更易于發(fā)生氧化損傷，此假說得到了研究人員的證明。

2.1.2 氧化損傷 體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)OTA可以導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷。ROS可以直接引起DNA氧化堿基的形成，形成的DNA氧化堿基又直接導(dǎo)致多種形式的DNA損傷。并且在腫瘤形成中通?？梢钥吹窖趸疍NA堿基引發(fā)的突變。OTA可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1和大鼠腎小管上皮細(xì)胞ROS生成增多，形成8-oxoguanine(DNA堿基氧化修飾，氧化損傷標(biāo)志物)[11, 12]。100 μM OTA處理60min誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y和小鼠海馬細(xì)胞HT22 發(fā)生氧化應(yīng)激[13]。OTA還可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人外周血單個核細(xì)胞和食管上皮細(xì)胞Het-1A發(fā)生DNA損傷，出現(xiàn)DNA鏈斷裂[14, 15]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察到同樣的現(xiàn)象，給予F344大鼠0.25，0.50，1.0和2.0 mg/(kg·d)OTA灌胃2周，彗星實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)肝、腎和脾細(xì)胞出現(xiàn)DNA鏈斷裂[16]。Kamp等[17]灌胃F344大鼠0.03, 0.1, 0.3 mg/kg bw/day OTA 4周，所有實(shí)驗(yàn)組動物出現(xiàn)肝和腎的氧化損傷。在肝臟和腎臟，DNA的損傷與DNA糖基酶Fpg有關(guān)。Fpg是一種DNA修復(fù)酶，參與氧化損傷DNA或者誘突變劑損傷DNA的堿基切除修復(fù)。其他研究者在給予動物廣泛劑量OTA處理后，在各種組織中均觀察到DNA氧化損傷?？寡趸瘎┛梢跃徑釵TA介導(dǎo)的DNA損傷，進(jìn)一步說明OTA誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷。例如，抗氧化劑N-acetyl-L-cysteine(NAC)可以降低OTA引起的人近端腎小管上皮細(xì)胞HK-2 DNA和人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1氧化損傷[11, 12]。

蛋白質(zhì)的羥基化作用通過多種氧化途徑發(fā)生。羥基化是一種重要的蛋白質(zhì)修飾方式，與蛋白(酶)功能改變、蛋白錯折疊和蛋白分解有關(guān)。組織中蛋白羥基化水平增高與很多疾病有關(guān)。由于哺乳動物細(xì)胞中細(xì)胞骨架蛋白含量豐富，如actin，多受到各種ROS和低分子量反應(yīng)性羥基的攻擊[18]。目前，關(guān)于OTA對蛋白羥基化作用影響的報(bào)道不一致。給予F344大鼠每天0.3 mg/kg體重OTA喂養(yǎng)4周，在肝和腎沒有觀察到蛋白質(zhì)氧化增加[17]。Wistar大鼠喂食OTA 289 μg/kg體重，90 d，在肝臟同樣沒有觀察到蛋白質(zhì)氧化增加[19]。但是，與之相反，Domijan等[20]在喂食Wistar大鼠每天0.5 mg/kg體重的第1、7、14和21天檢測蛋白質(zhì)氧化發(fā)現(xiàn)，大鼠的肝和腎中蛋白質(zhì)羥基在第14和21天明顯增加。體外研究也觀察到了蛋白質(zhì)的氧化形式。

自由基引起的反應(yīng)中研究最廣泛的是脂質(zhì)過氧化作用，其副產(chǎn)物中，HNE、MDA、丙烯醛和巴豆醛則研究較多。這些反應(yīng)性親電子物質(zhì)具有修飾DNA堿基的能力，引起突變性損傷，因此被認(rèn)為與氧化應(yīng)激脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的致突變性和致癌作用有關(guān)。已經(jīng)證實(shí)，癌癥發(fā)生過程中HNE和MDA會升高[6]。研究發(fā)現(xiàn)，OTA誘導(dǎo)MDA形成。最初時，Rahimtula[21]研究小組發(fā)現(xiàn)，將OTA加入到肝細(xì)胞或腎細(xì)胞的微粒體中，可以刺激脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)同樣如此。另有研究報(bào)道，OTA-鐵復(fù)合物刺激脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[8]。另外，有研究證實(shí)，OTA誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)可以導(dǎo)致微粒體釋放Ca2+[22]，給予動物模型不同的口服劑量OTA發(fā)現(xiàn)MDA生成增多，體外培養(yǎng)細(xì)胞給予OTA處理后可以檢測到HNE-蛋白加合物。

2.1.3 生物反應(yīng) 眾所周知，ROS可以觸發(fā)生物反應(yīng)，例如激發(fā)和抑制信號通路和基因表達(dá)。這些生物反應(yīng)可能參與了反應(yīng)性化學(xué)物質(zhì)的致癌機(jī)制。體內(nèi)外研究表明，氧化應(yīng)激作為信使參與OTA誘導(dǎo)的負(fù)面生物效應(yīng)。例如，OTA誘導(dǎo)自由基生成，增加細(xì)胞膜Ca2+通透性[22]。

2.2 OTA抑制蛋白合成 體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究均發(fā)現(xiàn)，OTA可以通過抑制肽鏈的延長而抑制蛋白質(zhì)合成，并且很多研究表明抑制蛋白合成與OTA的急性毒性作用有關(guān)。抑制蛋白質(zhì)合成是OTA的一種主要作用，與抑制RNA和DNA的合成有關(guān)。最近的遺傳毒理學(xué)研究報(bào)道，長期喂食大鼠致癌劑量的OTA可以明顯降低RNA和蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步說明OTA具有抑制蛋白質(zhì)合成的作用[23]。

2.3 OTA與細(xì)胞信號

2.3.1 絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases，MAPKs) 是信號級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵部件，涉及磷酸化激活的反應(yīng)，調(diào)控信號從細(xì)胞膜到細(xì)胞核的傳導(dǎo)。ERK、JNK和P38是主要的MAP激酶，調(diào)控哺乳動物細(xì)胞生理學(xué)的許多方面。一般認(rèn)為，ERK負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，JNK和P38更傾向于參與應(yīng)激反應(yīng)和凋亡。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，OTA誘導(dǎo)ERK1/2、JNK和P38磷酸化[24, 25]。喂養(yǎng)雄性大鼠致癌劑量OTA 7、21 d和12個月，OTA影響腎組織中MAPK的表達(dá)和磷酸化。經(jīng)分析，ERK上游的效應(yīng)器為胰島素樣生長因子(IGF-1)，(IGF)-PI3K-PKB 通路可能參與OTA介導(dǎo)的雄性大鼠腎毒性[26]。腎腫瘤中的信號級聯(lián)作用已經(jīng)廣泛研究。一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活、抗凋亡活性和腎腫瘤發(fā)展與IGF-1系統(tǒng)的刺激、蛋白激酶C活性的增加和MAPK-ERK的激活有直接關(guān)系。并且動物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也支持MAPK級聯(lián)激活與腎腫瘤相關(guān)。

2.3.2 Ca2+動態(tài)平衡 Ca2+是重要的細(xì)胞信號，例如涉及鈣調(diào)蛋白和蛋白激酶C的激活，且鈣動態(tài)平衡失衡是毒素?fù)p傷的早期和關(guān)鍵事件。體外實(shí)驗(yàn)表明OTA影響細(xì)胞內(nèi)的Ca2+平衡[22]。但是，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)只有有限的且不一致的關(guān)于OTA和Ca2+平衡的結(jié)果[27]。有研究報(bào)道，鈣調(diào)素抑制大鼠腎皮質(zhì)的DNA合成，并且抑制肝癌細(xì)胞的腫瘤活性[28]。

3 OTA誘發(fā)多種細(xì)胞效應(yīng)

3.1 細(xì)胞毒性和細(xì)胞死亡 高濃度OTA引起強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激和抑制蛋白合成，從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性和細(xì)胞死亡。眾所周知，毒性作用可能誘發(fā)細(xì)胞的再生和增殖，這可能導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)展?？傊?，近期的研究表明組織再生和細(xì)胞增殖可能參與了OTA的致癌作用[29]。

3.2 凋亡 在一定水平上，氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡，即凋亡，是有別于壞死的積極過程。一些研究表明，OTA可以誘導(dǎo)體內(nèi)外細(xì)胞發(fā)生凋亡。隨著腫瘤的發(fā)展，凋亡的作用是難以定義的。通常認(rèn)為凋亡去除異常細(xì)胞而阻止腫瘤的發(fā)展。但是，基于體外實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，一些學(xué)者主張OTA的介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡引起抗凋亡細(xì)胞的選擇，這極有可能導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞[14]。此外，因?yàn)閴乃篮偷蛲龃碳ご鷥敿?xì)胞損失反應(yīng)能力，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和癌癥的發(fā)展。

3.3 轉(zhuǎn)化與增殖 除了導(dǎo)致DNA損傷，持續(xù)的低水平的氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。這最終可轉(zhuǎn)換成基因突變的DNA損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11]。

綜上所述，OTA不是通過單一的、定義明確的機(jī)制發(fā)揮作用的，而是一個復(fù)雜的、相互聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。抑制蛋白合成、氧化應(yīng)激、特定信號通路的激活都參與了OTA的致癌機(jī)制。其中，關(guān)于氧化應(yīng)激機(jī)制越來越受到人們的關(guān)注。一些專家認(rèn)為，OTA介導(dǎo)的氧化應(yīng)激在OTA誘導(dǎo)的腎腫瘤的發(fā)生中起著舉足輕重的作用。總之，有力的證據(jù)表明OTA可以引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，并且氧化應(yīng)激參與OTA致癌。

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(2016-08-23收稿 2016-10-15修回)

(責(zé)任編輯 張 楠)

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(基金代碼 81171889)

劉 靜，博士，講師。

100039 北京，武警總醫(yī)院 1.病理科，2.質(zhì)量管理科；

3.050017 石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)病理研究室

張祥宏，E-mail：zhangxianghong2008@163.com

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