李劍萍 潘能浪 謝志偉 楊可立 關(guān)玉娟 唐小平

510060 廣州市第八人民醫(yī)院肝病科

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)感染引起的丙型肝炎仍是嚴(yán)重危害人民健康的重要疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球丙型肝炎病毒感染率約為3%，估計(jì)有1.7億人感染HCV。HCV感染后55%～85%的患者發(fā)展為慢性感染；在HCV感染后20年，一般人群肝硬化發(fā)生率為5%～15%[1]；一旦發(fā)展為失代償期肝硬化，10年的生存率僅為25%[2]。直接抗病毒(Direct-acting antiviral，DAA)藥物已在國(guó)外廣泛應(yīng)用，并取得了很好的抗丙肝病毒療效，但目前國(guó)內(nèi)小分子藥物尚未上市，聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林治療仍是目前國(guó)內(nèi)的抗丙型肝炎病毒感染的標(biāo)準(zhǔn)療法；在目前的標(biāo)準(zhǔn)治療方案下，丙型肝炎1/4基因型患者的SVR率為40%～54%，而2/3基因型患者可獲得65%～82%的SVR[3-4]，文獻(xiàn)報(bào)道其治療效果受宿主及病毒因素影響，如患者的年齡、體重、感染時(shí)間、HCV RNA水平、HCV基因型及IL28B基因多態(tài)性[5-6]。并且研究發(fā)現(xiàn)miR-122表達(dá)水平[7]、IL28B基因多態(tài)性和HCV準(zhǔn)種[8]與個(gè)體干擾素療效密切相關(guān)。

MicroRNA (miRNA) 是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度為 22 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈 RNA 分子， 它們?cè)趧?dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。 miR-122 是在肝臟特異高表達(dá)的一種 microRNA，占肝臟 miRNAs70%，在整個(gè)肝臟發(fā)育過(guò)程中有著非常重要的調(diào)節(jié)作用[9-10]。miR-122 是目前通過(guò)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)的第一個(gè)與 HCV 復(fù)制有關(guān)的microRNA[11]。國(guó)內(nèi)李蘇娟[12]研究表明在細(xì)胞感染模型中 miR-122 不但促進(jìn) HCV 的復(fù)制， 而且 miR-122 的表達(dá)可部分中和 IFN-a 的抗 HCV 效應(yīng)。 而靜默 miR-122 的表達(dá)可通過(guò)調(diào)節(jié) SOCS3(Suppressor of cytokine signaling，細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控蛋白 3) 的啟動(dòng)子的甲基化而達(dá)到增強(qiáng) IFN-a 抗病毒的作用[13]。同時(shí)研究表明 miRNA 的表達(dá)水平與 HBV 感染有密切關(guān)系[14]。 其中 HBV 感染患者的肝臟miR-122 的表達(dá)明顯低于健康對(duì)照者， miR-122 水平與肝內(nèi)病毒載量及肝臟炎癥程度呈負(fù)相關(guān)， 而通過(guò)抑制內(nèi)源性的 miR-122 可增強(qiáng) HBV 復(fù)制[15]。因此，從目前的研究可以看出， miRNA-122 與丙肝病毒及乙肝病毒的復(fù)制密切相關(guān)，其表達(dá)水平可能與抗病毒療效有關(guān)。 目前 miR-122 與 慢性丙型肝炎(Chronic hepatitis C，CHC)干擾素抗病毒療效關(guān)系的體外研究較多，但國(guó)內(nèi)相關(guān)臨床研究報(bào)道較少。本課題旨在研究廣東地區(qū)的慢丙肝患者肝組織和血清中 miR-122 的表達(dá)水平與慢丙肝臨床治療的相關(guān)性， 探討是否可將miR-122 作為干擾素療效的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象按照2004 年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病和寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì)與肝病學(xué)分會(huì)于聯(lián)合制定的《丙型肝炎防治指南》標(biāo)準(zhǔn)，篩選來(lái)自廣州市第八人民醫(yī)院的基因 1 型 CHC 患者40例為研究對(duì)象，除外其他病毒重疊感染、酒精性肝病、自身免疫性肝病等，均無(wú)聚乙二醇干擾素α聯(lián)合利巴韋林治療的禁忌癥，其中男性24例(60%)，女性16例(40%)，平均年齡(43.83±13.24)歲。

1.2方法

1.2.1 治療方法：采用聚乙二醇干擾素α-2 a(PEG-IFN α-2 a) 180 μg或135 μg(上海羅氏制藥有限公司 規(guī)格 180 μg/支和135 μg/支)或聚乙二醇干擾素α-2b (PEG-IFN α-2b)80 μg或50 μg(默沙東(中國(guó))有限公司 規(guī)格 80 μg/支和50 μg/支)，皮下注射，每周1次，療程48周。利巴韋林(ribavirin) 800～1 200 mg (廣東華南藥業(yè)有限公司 規(guī)格0.1 g/片),每d分次口服，療程48周。

1.2.2 觀察指標(biāo):治療過(guò)程中對(duì)生化及病毒學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。生化指標(biāo)采用美國(guó)貝克曼公司全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)病毒學(xué)指標(biāo)：采用PCR微板核酸雜交酶聯(lián)免疫法檢測(cè)HCV基因型(試劑盒購(gòu)自廣州藍(lán)星生物科技開(kāi)發(fā)公司)，HCV RNA定量檢測(cè)采用羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司COBAS Taq man 定量檢測(cè)試劑盒。HCV RNA<15IU/ml為陰性。miR-122：采用熒光定量PCR法檢測(cè)血清miR-122(引物為廣州銳博公司設(shè)計(jì))；IL28B基因型：采用聚合酶鏈-連接酶檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)行分型(試劑盒購(gòu)自廣東東盛生物有限公司)(檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)：治療前、治療4周、12周、24周、36周、48周及治療結(jié)束后24周)。

1.2.3 療效評(píng)價(jià):根據(jù)PEG-IFN α聯(lián)合利巴韋林治療結(jié)束后隨訪24周HCV RNA是否小于15IU/ml，分為持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答組(sustained virological response，SVR)和非持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答組(non sustained virological response，NSVR)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢測(cè)結(jié)果采用均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料采用t檢測(cè)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；線性回歸用來(lái)評(píng)估變量之間的相關(guān)性。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1聚乙二醇干擾素α聯(lián)合利巴韋林治療CHC患者療效本研究治療結(jié)束后隨訪24周時(shí)有29例(72.50%)患者出現(xiàn)SVR，11例(27.5%)為NSVR。

2.2SVR組與NSVR組基線指標(biāo)比較SVR組患者與NSVR組患者比較，基線HCV RNA載量、總膽紅素 (Total bilirubin,TBIL) 水平、甲胎蛋白 (Alpha fetoprotein, AFP) 水平、肝臟硬度值(Fibroscan)、層粘連蛋白水平均更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IL28B基因型有差異(P<0.05)；NSVR組基線血清miR-122水平為SVR組的3倍，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組患者年齡、BMI、性別等無(wú)明顯差異，見(jiàn)表1。

表1 兩組患者的基線特征Tab.1 Baseline Characteristics of two groups of patients

注：合并疾病采用的均為四格表資料的Fisher確切概率法

Note：Data of the combined diseases were all analyzed with exact probability methods of 2 by 2 tables

2.3基線血清miR-122水平與慢性丙型肝炎聚乙二醇干擾素α治療應(yīng)答的關(guān)系SVR組和NSVR組基線miR-122水平分別為0.086±0.184和0.223±0.355，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.246)，見(jiàn)圖1。

圖1 基線血清miR-122水平與慢性丙型肝炎聚乙二醇干擾素α治療應(yīng)答的關(guān)系Fig.1 The relationship between baseline MiR-122 level and response of patients with chronic hepatitis C treated with peg-interferon α

2.4SVR組與NSVR組患者miR-122最后一次測(cè)量值與基線值之間的差值比較兩組患者最后一次miR-122水平測(cè)量時(shí)間為治療結(jié)束后隨訪24周時(shí)。miR-122差值定義為最后一次測(cè)量值與基線值之間的差值。SVR組患者miR-122差值為0.044±0.239，NSVR組患者miR-122差值為0.215±0.355，兩組患者miR-122差值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.481,P=0.161)，見(jiàn)圖2。

圖2 SVR組與NSVR組患者miR-122最后一次測(cè)量值與基線值之間的差值比較Fig.2 The change of MiR-122 level from baseline to the last available measurement between SVR group and NSVR group

2.5慢性丙型肝炎患者基線血清miR-122水平與病毒學(xué)、生化、纖維化指標(biāo)的關(guān)系慢丙肝患者基線血清miR-122水平與基線HCV RNA載量、ALT水平、AST水平、TBIL水平、AFP水平、凝血酶原時(shí)間、層粘連蛋白水平、透明質(zhì)酸水平，Ⅲ型前膠原肽水平、IV型膠原水平、肝臟硬度值之間無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 基線血清miR-122 線性回歸分析Tab.2 Baseline miR-122 level linear regression analysis

3 討論

CHC是終末期肝病的主要病因，CHC一旦進(jìn)展為肝硬化，那么疾病可能會(huì)進(jìn)入“加速”階段，此時(shí)若不進(jìn)行規(guī)范、有效的抗病毒治療，則疾病很快將進(jìn)展為失代償階段，發(fā)生肝細(xì)胞癌的比例也將提高；目前有許多研究發(fā)現(xiàn)患者年齡、體重、感染時(shí)程，HCV RNA載量、HCV基因型、IL28B多態(tài)性等宿主、病毒因素均可影響抗病毒療效。

MicroRNA是一類約為22個(gè)堿基的小分子非編碼RNA，主要與靶基因Mrna 3′非編碼區(qū)部分互補(bǔ)，促進(jìn)靶基因mRNA降解或抑制其翻譯過(guò)程而發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用[16]。

MicroRNA-122(miR-122)是含有22個(gè)堿基的肝臟特異性miRNA[17]，并且是肝臟中表達(dá)最豐富的miRNA[18]。miR-122的主要生理功能是調(diào)節(jié)脂質(zhì)和膽固醇的代謝。Jopling等[19]體外研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)HCV病毒的復(fù)制依賴于miR-122的表達(dá)狀態(tài)，只有在表達(dá)miR-122的Huh 7細(xì)胞中HCV才能復(fù)制；研究亦發(fā)現(xiàn)[20-21]，在慢性丙型肝炎及丙肝相關(guān)性肝硬化、肝癌患者血清中miR-122水平是顯著高于HCV陰性的人群，且血清miR-122與ALT水平、呈正相關(guān)，并提出miR-122可作為丙肝相關(guān)性肝癌診斷的一個(gè)標(biāo)志物。Su等[22]報(bào)道，①血清miR-122與血漿(r=0.943)及肝臟(r=0.51)miR-122存在相關(guān)性，②基線血清miR-122肝臟組織活動(dòng)指數(shù)(hepatic histology activity index，HAI) 評(píng)分及血清ALT存在正相關(guān)，但與HCV病毒載量、肝臟纖維化及血脂無(wú)相關(guān)性，③獲得完全早期應(yīng)答(complete early virologic response, cEVR) 或SVR患者較NR患者有更高的基線miR-122水平。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)NSVR組基線血清miR-122水平較SVR組高3倍，這也驗(yàn)證了miR-122的存在可以促進(jìn)HCV的復(fù)制，但兩組血清miR-122水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮①本研究測(cè)得miR-122值為非正態(tài)分布，個(gè)別值離散程度大，②研究病例數(shù)較少；我們亦未發(fā)現(xiàn)血清miR-122與HCV RNA載量存在相關(guān)性，與既往報(bào)道相符；而在整個(gè)研究中，本研究亦未發(fā)現(xiàn)血清miR-122與其他指標(biāo)存在相關(guān)性，考慮為本研究納入病例數(shù)少，且miR-122值為非正態(tài)分布，個(gè)別值離散程度大。

本研究旨在分析血清miR-122與SVR的關(guān)系，并且比較SVR與NSVR基線病毒指標(biāo)、生化指標(biāo)等的差異。在本研究中發(fā)現(xiàn)，SVR組與NSVR組比較，基線HCV RNA載量、AFP及Fibrosacn均較低，這與Mabrouk等[23]報(bào)道的一致。Safarnezhad等[6]發(fā)現(xiàn)在SVR組患者中IL28B CC基因型占90.9%，隨之是CT基因型(54%)及TT基因型(25%)，Ge 等[24]亦發(fā)現(xiàn)不管是在European-Americans、African-Americans 還是Hispanics，IL28B rs12979860 與SVR強(qiáng)烈相關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)主要是IL28B rs12979860 CC基因型與SVR相關(guān)。在研究中我們亦發(fā)現(xiàn)SVR組患者中IL28B 基因型主要為CC基因型(占93.10%)，而SVR組CC基因型占54.55%。本研究中SVR組較NSVR組基線總膽紅素水平低，總膽紅素水平反映肝臟代謝功能，有研究發(fā)現(xiàn)基線高總膽紅素水平預(yù)示肝功能失代償，肝功能失代償會(huì)降低抗病毒治療的效果甚至增加治療的風(fēng)險(xiǎn)。層粘連蛋白作為肝纖維化指標(biāo)，其升高提示肝纖維化傾向，在本研究中也發(fā)現(xiàn)基線層粘連蛋白水平高的患者不易獲得SVR。既往研究也發(fā)現(xiàn)年齡、性別、ALT、AST等與應(yīng)答相關(guān)，但在本研究中未發(fā)現(xiàn)上述因素與應(yīng)答相關(guān)，考慮與本研究的病例數(shù)較少有關(guān)。

綜上所述，HCV RNA載量、IL28B基因型及肝臟纖維化程度均可應(yīng)答聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林抗丙肝病毒療效，血清miR-122可能對(duì)抗病毒療效發(fā)揮關(guān)鍵作用。由于本研究樣本例數(shù)較少，還需要通過(guò)增加樣本數(shù)及進(jìn)一步深入的生物學(xué)研究闡明其調(diào)控機(jī)制，從而有望發(fā)現(xiàn)miR-122在抗病毒治療中發(fā)揮更大的作用。

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