陳國清 李春香 王瑤 李峰 徐士林 李長城 邵榮標(biāo)

224001 鹽城市疾病預(yù)防控制中心(陳國清、王瑤、李峰、徐士林、李長城、邵榮標(biāo))；224002 鹽城市婦幼保健院(李春香)陳國清、李春香對本文同等貢獻(xiàn)

麻疹是由麻疹病毒(Measles, MV)引起的全球性急性病毒性傳染病，被感染者以發(fā)熱、出疹、呼吸道卡他癥狀為主要臨床特征，特別是5歲以下嬰幼兒感染后容易引起肺炎、包涵體腦炎、亞急性硬化性全腦炎(SSPE)等并發(fā)癥和后遺癥[1-2]。麻疹病毒為有包膜單股負(fù)鏈不分節(jié)段RNA病毒，其中編碼的核蛋白(Nucleoprotein, N)和血凝素蛋白(Hemagglutinin, HA)基因變異最大，根據(jù)N基因羧基末端450核苷酸序列特征，全球流行或者曾經(jīng)流行的麻疹病毒分為8個基因組，24個基因群[3-5]。目前，人群感染的麻疹病毒來源主要有各區(qū)域本土優(yōu)勢流行循環(huán)野毒株、輸入性野毒株以及疫苗相關(guān)株，局部地區(qū)時有麻疹的暴發(fā)流行。自將麻疹疫苗納入免疫規(guī)劃以后，中國的麻疹報告發(fā)病率和死亡人數(shù)大幅降低，但各地麻疹報告發(fā)病率時有反復(fù)，為了解鹽城地區(qū)麻疹病毒基因型流行特征以及溯源麻疹病毒進(jìn)化路徑，對2016年鹽城地區(qū)流行的麻疹病毒進(jìn)行基因型分型及對其HA基因進(jìn)行分子進(jìn)化特征分析，從分子水平上掌握麻疹病毒的基因變異與流行的關(guān)系，從基因?qū)用嫣接懍F(xiàn)用疫苗的保護(hù)效果，為鹽城市防控麻疹病毒的流行提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源由各縣市區(qū)醫(yī)療機(jī)構(gòu)以及各疾控機(jī)構(gòu)按照麻疹監(jiān)測方案要求，采集2016年鹽城市各縣市區(qū)疑似麻疹病例咽拭子，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2014版《全國麻疹監(jiān)測方案》，采集的標(biāo)本在冷藏條件下48 h內(nèi)送到市疾控中心麻風(fēng)疹分子網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室。

1.2方法

1.2.1 核酸提取和熒光RT-PCR檢測：用Qiagen公司QiaAmp Viral RNA Mini Kit(Cat No：52904)提取疑似麻疹病例RNA。采用麻疹、風(fēng)疹雙通道實(shí)時熒光RT-PCR核酸檢測試劑盒(江蘇碩世生物科技有限公司)，篩選出麻疹病毒核酸陽性樣本。實(shí)驗(yàn)過程質(zhì)量控制以及結(jié)果判斷嚴(yán)格參照試劑盒說明書。

1.2.2 麻疹病毒核蛋白基因核苷酸序列RT-PCR擴(kuò)增：以麻疹病毒核酸陽性的標(biāo)本為模板，采用TaKaRa公司one step RT-PCR Kit和全式金生物公司2×EasyTaq PCR SuperMix Kit試劑盒，通過自設(shè)的引物對麻疹病毒核蛋白羧基末端450個核苷酸序列進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，第1輪進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，引物序列為F1：5′-TATCMACACTTGARTCCYTG-3′，R：5′-TGTGGACYTGGWTCCTAAG-3′，參照試劑盒說明書配置反應(yīng)體系50 μl，其中模板RNA 2 μl。擴(kuò)增條件：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)，72 ℃ 10 min；取第1 輪擴(kuò)增產(chǎn)物2 μl為模板，內(nèi)側(cè)引物序列為F2：5′-GGAGCTATGCMATGGGAGT-3′，R：5′-TGTGGACYT GGWTCCTAAG-3′，進(jìn)行第2 輪PCR，參照試劑盒說明書配置反應(yīng)體系50 μl。擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)，72 ℃ 10 min，長度660 bp，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)。

1.2.3 麻疹病毒血凝素蛋白基因全長編碼區(qū)核苷酸序列擴(kuò)增：運(yùn)用自設(shè)的引物對麻疹病毒血凝素蛋白基因全長編碼區(qū)序列進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，PCR試劑盒為上述兩種。第1輪進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，引物序列為F1：5′-GTTGGYATGTCAAGRCCAGG-3′，R：5′-GGTTRACRGAYAGCGAGTCC-3′，擴(kuò)增條件：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，共30個循環(huán)，72 ℃ 10 min；取第1 輪擴(kuò)增產(chǎn)物2 μl為模板，F(xiàn)2：5′-CTTAGGRTGCAAG AYCATCC-3′，R：5′-GGTTRACRGAYAGCGAGTCC-3′，作為內(nèi)側(cè)引物進(jìn)行第2 輪PCR，擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s，52 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)，72 ℃ 10 min，長度2 008 bp，體系配置參照上述反應(yīng)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)。

1.2.4 麻疹病毒核蛋白基因、血凝素蛋白基因序列測定與分析：將電泳后具有單一目的條帶核蛋白基因(660 bp)、血凝素蛋白基因(2 008 bp)PCR未純化產(chǎn)物送上海生工公司進(jìn)行測通，經(jīng)拼接的序列Blast比對，確認(rèn)麻疹病毒核蛋白基因和血凝素蛋白基因。從GenBank數(shù)據(jù)庫選取近年國內(nèi)外麻疹病毒參考株(包括24個基因型的代表株)、 中國疫苗株滬S191序列等，使用DNAStar中MegAlign軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列同源性分析，mafft方法進(jìn)行核苷酸序列比對分析，采用MEGA6.0軟件相鄰連接法(Neighbor-Joining method)構(gòu)建親緣關(guān)系進(jìn)化樹，Bootstrap值取1 000進(jìn)行可靠性評估。

2 結(jié)果

2.12016年鹽城地區(qū)麻疹病毒核蛋白基因、血凝素蛋白基因RT-PCR鹽城市2016年1～5月共采集45例疑似麻疹患者咽拭子標(biāo)本，經(jīng)實(shí)時熒光RT-PCR檢測，共獲得26例麻疹病毒核酸陽性，陽性率57.78%(26/45)。按1～5流行月分別隨機(jī)選取1株、2株、3株、5株、5株麻疹病毒核酸陽性共16株標(biāo)本，進(jìn)行N基因、HA基因RT-PCR巢式擴(kuò)增，分別獲得15株N基因條帶(660 bp)，14株HA基因條帶(2 008 bp)，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.22016年鹽城地區(qū)流行的麻疹病毒基因型分子分型按1～5流行月隨機(jī)選取鹽城市2016年麻疹病毒核酸陽性標(biāo)本共16株，對麻疹病毒N基因羧基末端450 bp核苷酸進(jìn)行巢式擴(kuò)增、純化、測序，獲得15株有效序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中24個基因型代表株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行基因型的分析。根據(jù)序列親緣關(guān)系進(jìn)化分析顯示：5株為H1a基因亞型，10株為D8基因型。見圖1。

● 表示2016年鹽城地區(qū)麻疹病毒代表株；▲表示中國疫苗株滬S191圖1 鹽城2016年麻疹病毒代表株核蛋白基因羧基末端450個核苷酸序列與各基因型參考株序列系統(tǒng)進(jìn)化樹● Strains of measles viruses in Yancheng area in 2016; ▲ Chinese vaccine of Shanghai S191Fig.1 Phylogenetic tree of the N gene sequences of 450 nucleotide of C-terminal of measles viruses in Yancheng area in 2016 and different genotypes reference strains of measles viruses

2.3鹽城地區(qū)不同基因型麻疹病毒N基因和HA基因核苷酸和氨基酸同源性分析隨機(jī)選取的16株麻疹病毒核酸陽性的咽拭子標(biāo)本，經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增N基因(羧基末端450 bp片段)和H基因(全長編碼區(qū)1 854 bp片段)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化、測序，分別獲得15株N基因序列和12株HA基因序列，獲得序列都沒有核苷酸的插入或者缺失。15株N基因序列組內(nèi)核苷酸和氨基酸同源性分別為90.7%～100%和90.0%～100%。其中，5株H1a亞型毒株N基因序列組內(nèi)核苷酸和氨基酸同源性分別為99.1%～100%和100%，10株D8基因型毒株N基因序列組內(nèi)核苷酸和氨基酸同源性分別為99.6%～100%和98.7%～100%。12株HA基因序列組內(nèi)核苷酸和氨基酸同源性分別為93.2%～100%和94.1%～100%。其中，5株H1a亞型毒株HA基因序列組內(nèi)核苷酸和氨基酸同源性分別為99.8%～99.9%和99.5%～100%，7株D8基因型毒株HA基因序列組內(nèi)核苷酸和氨基酸同源性分別為99.9%～100%和99.7%～100%。H1a基因亞型與D8基因型鹽城代表株N基因、HA基因與各參考株核苷酸、氨基酸同源性見表1。

2.4鹽城地區(qū)不同基因型麻疹病毒HA基因全長編碼區(qū)核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析5株H1a亞型和7株D8基因型鹽城代表株HA基因全長編碼區(qū)1 854 bp核苷酸序列分別與GenBank數(shù)據(jù)庫中選取的近年國內(nèi)外相應(yīng)基因型參考株構(gòu)建HA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，以疫苗株滬S191為組外對照。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明：國內(nèi)主流的H1a基因亞型的毒株根據(jù)聚類毒株流行的時間關(guān)系分為H1a-1和H1a-2兩大基因群的進(jìn)化分支。其中，鹽城地區(qū)5株H1a代表株與江西代表株(KJ136545)聚類成獨(dú)立的進(jìn)化小分支，與湖北代表株(KM385536、KM385535)、山東代表株(JN997514、JN997503)、青海代表株(JN997501)以及安徽代表株(JN997518)親緣關(guān)系相近，在同一個進(jìn)化譜系中，屬H1a-1進(jìn)化基因群分支；D8基因型毒株根據(jù)聚類毒株的親緣關(guān)系分為3個進(jìn)化分支，分別為D8-1、D8-2、D8-3。1998年加拿大代表株(AF410985)單獨(dú)聚成D8-1進(jìn)化分支，7株鹽城代表株與2009年美國代表株(JN635404)聚集成簇，與1994年英國代表株(U29285)親緣關(guān)系相近，聚成D8-3分支中D8-3-2小分支基因群毒株，逐漸遠(yuǎn)離D8-1、D8-2進(jìn)化分支基因群的毒株。見圖2。

表1 鹽城市2016年麻疹病毒代表株N基因、HA基因與各參考株核苷酸和氨基酸同源性分析

● 表示2016年鹽城地區(qū)H1a基因亞型麻疹病毒代表株；▲表示2016年鹽城地區(qū)D8基因型麻疹病毒代表株圖2 鹽城2016年H1a基因亞型(A)、D8基因型(B)麻疹病毒HA基因全長編碼區(qū)核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹●Subgenotype H1a strains of measles viruses inYancheng area in 2016; ▲Genotype D8 strains of measles viruses inYancheng area in 2016Fig.2 Phylogenetic tree of the complete HA gene sequences of subgenotype H1a(A) and genotype D8(B)strains of measles viruses in Yancheng area in 2016

2.5鹽城地區(qū)不同基因型麻疹病毒HA基因全長編碼區(qū)氨基酸位點(diǎn)變異分析2016年鹽城地區(qū)12株麻疹病毒代表株相對于疫苗株滬S191(U03663)共涉及43個氨基酸位點(diǎn)的變異，變異率為6.97%(43/617)，其中，5株H1a基因亞型毒株共涉及31個氨基酸位點(diǎn)的變異，變異率為5.02%(31/617)，7株D8基因亞型毒株共涉及18個氨基酸位點(diǎn)的變異，變異率為2.92%(18/617)。麻疹滬S191疫苗株HA基因編碼蛋白5個N-糖基化位點(diǎn)分別涉及168、187、200、215、238五個氨基酸位點(diǎn)，416位N-糖基化位點(diǎn)存在少數(shù)毒株中[6]，氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，鹽城地區(qū)5株H1a代表株與疫苗株滬S191相比240位氨基酸發(fā)生了S240 N的變異，丟失了238位N-連接的糖基化位點(diǎn)，7株D8基因型代表株未發(fā)生N-糖基化位點(diǎn)的變化。與線性血凝素蛋白抗原表位(linear hemagglutinin noose epitope, HNE)相關(guān)的第397位點(diǎn)[7]，5株H1a基因亞型的毒株發(fā)生了P397 L位點(diǎn)的變異，7株D8基因型毒株397位點(diǎn)未發(fā)生變異。麻疹病毒HA基因編碼氨基酸的B細(xì)胞抗原表位主要位于236～250位點(diǎn)上[8]，除5株H1a代表株240位氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變異外，12株麻疹病毒代表株均未發(fā)生B細(xì)胞抗原表位氨基酸位點(diǎn)的變異。見表2。

3 討論

通過此次研究，發(fā)現(xiàn)2016年鹽城地區(qū)主要有H1a基因亞型、D8基因型兩種型別的毒株流行。據(jù)1993年許文波等[9]研究，中國當(dāng)時流行的麻疹病毒主要以H1基因型為主，分為H1a、H1b、H1c三個基因亞型。近年，H1a基因亞型麻疹毒株成為中國本土絕對優(yōu)勢流行循環(huán)毒株[10-11]。2016年鹽城地區(qū)流行的H1a基因亞型毒株正是國內(nèi)主流優(yōu)勢循環(huán)株。

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明：H1a基因亞型的毒株在中國本土的流行具有明顯的時空進(jìn)化遷徙特征，H1a-2進(jìn)化分支的毒株流行于2003-2013年，分布于上海、江西、海南、河北、江蘇、浙江、貴州等地，2013年后，該基因群的毒株較為少見，H1a-1進(jìn)化分支的毒株流行于2005-2016年，流行于青海、安徽、山東、湖北、江西等地，該分支基因群的毒株為優(yōu)勢進(jìn)化分支，鹽城5株H1a基因亞型毒株聚集成簇，形成眾多分支，具有不同的傳播支鏈，與2012年江西代表株(KJ136545)形成獨(dú)立的進(jìn)化分支，共享一條傳播主鏈。鹽城7株D8基因型毒株與2009年美國代表株(JN635404)聚集成簇，形成獨(dú)立的進(jìn)化分支，共享一個傳播主鏈，同英國代表株(U29285)在一個進(jìn)化分支中，與加拿大代表株(KF591391、KJ018971)、德國代表株(JQ417681、FJ808738)、英國代表株(KT732232、KT732261)、印度代表株(FJ719489、FJ387143)、越南代表株(KU728743)、美國代表株(JN635407)等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，推測鹽城流行的D8基因型毒株可能來源于美國。經(jīng)現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查，鹽城各縣市區(qū)采集的疑似麻疹病例都是散發(fā)病例，病例之間沒有流行病學(xué)關(guān)聯(lián)，因2016年以前鹽城地區(qū)從未在分子水平上開展過麻疹病毒基因特征的分析，本地流行的麻疹病毒基因型別背景不清晰，經(jīng)本研究結(jié)果推斷：輸入性D8基因型麻疹毒株已經(jīng)導(dǎo)致本地廣泛流行，流行的強(qiáng)度可能高于H1a基因亞型。D8基因型毒株地理分布廣泛，過去印度等東南亞國家為主要流行區(qū)，自2012年上海發(fā)現(xiàn)中國首例輸入性D8基因型毒株后，其他省份如湖北、北京和廣東等地也發(fā)現(xiàn)有D8基因型毒株的流行[12-15]，這種輸入性D8基因型毒株在中國的流行值得關(guān)注，是否會成為中國優(yōu)勢流行基因型毒株，還要通過長期的監(jiān)測數(shù)據(jù)來分析。

對2016年鹽城地區(qū)12株麻疹病毒HA基因編碼氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)：相對于疫苗株滬S191，鹽城地區(qū)5株H1a代表株240位氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了S→N的變異，由此丟失了238位N-連接的糖基化位點(diǎn)，因糖基化位點(diǎn)影響到麻疹病毒血凝素蛋白抗原性以及空間結(jié)構(gòu)的折疊，可能會影響H1a基因亞型麻疹病毒免疫原性發(fā)生變化，7株D8基因型代表株未發(fā)生N-糖基化位點(diǎn)的變化。與線性血凝素蛋白抗原表位相關(guān)的第397位點(diǎn)，5株H1a基因亞型的毒株為Leu，不同于疫苗株，導(dǎo)致一個潛在的血凝素抗原表位的丟失；7株D8基因型毒株397位點(diǎn)未發(fā)生變異。麻疹病毒HA編碼的617個氨基酸包含13個半胱氨酸殘基，其中第287、300、381、394、494、579、583位點(diǎn)[14]7個位點(diǎn)與抗原結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)加工有關(guān)，鹽城地區(qū)12株麻疹病毒HA蛋白分子上與抗原結(jié)構(gòu)相關(guān)的7個半胱氨酸位點(diǎn)未發(fā)生變化，B細(xì)胞抗原決定簇第236～250氨基酸位點(diǎn)非常保守，除5株H1a代表株240位氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變異外，12株麻疹病毒代表株均未發(fā)生B細(xì)胞抗原表位氨基酸位點(diǎn)的變異。從對麻疹病毒HA基因和氨基酸序列研究的分子水平看，5株H1a基因亞型麻疹代表株要比7株D8基因型代表株變異度活躍，但總體來看，鹽城地區(qū)麻疹病毒HA蛋白氨基酸變異程度對病毒本身抗原性和免疫原性影響不大。

綜上所述，2016年鹽城地區(qū)有兩種基因型麻疹野毒株的流行，分別為我國H1a優(yōu)勢基因亞型和D8輸入性基因型野毒株，麻疹病毒HA基因一直處于非抗原決定簇氨基酸位點(diǎn)點(diǎn)突變的抗原漂移積累變化中。從麻疹病毒HA基因的核苷酸和氨基酸的分子水平分析，現(xiàn)有疫苗株滬S191對鹽城地區(qū)兩種基因型別的麻疹野毒株仍具有保護(hù)力，今后要不斷加強(qiáng)麻疹病毒HA基因分子變異的動態(tài)監(jiān)測，了解基因變異對抗原的影響，高度重視D8輸入性基因型毒株在鹽城地區(qū)的流行。

[1] 施勇, 熊英, 李健雄, 等．2008—2012年江西省麻疹病毒分離株N基因特征分析[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2015, 42(5): 908-911.

[2] 高凌玉, 張燕, 王慧玲, 等．中國大陸1993—2013年流行的麻疹病毒H1基因型血凝素基因變異特征[J]. 病毒學(xué)報, 2017, 33(2):150-155. doi：10. 13242/cma. j. issn. 1000-8721.

[3] Zhang Y, Ding ZR, Wang HL, et al. New measles virus genotype associated with outbreak, China[J]. Emerg Infect Dis, 2010, 16(6):943-947. doi：10. 3201/eid1606. 100089.

[4] 孫海燕, 崔大偉, 童海江．浙江省麻疹病毒的基因特征分析[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志, 2017, 29(1): 30-36.doi：10. 13381/cma. j. issn. 1005-376X.

[5] 黃泓滟, 周淑潔, 靳玉惠, 等．合肥市71例麻疹病例麻疹病毒基因型分析[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2016, 43(8): 1486-1490.

[6] 任麗, 王慧玲, 王常銀, 等．2013—2014年中國大陸四株不同基因型麻疹病毒分離株血凝素基因特征分析[J]. 病毒學(xué)報, 2016, 32(4): 454-458.doi：10. 13242/cma. j. issn. 1000-8721.

[7] Finsterbusch T, Wolbert A, Deitemeier I, et al. Measles viruses of genotype H1 evade recognition by vaccine-induced neutralizing antibodies targeting the linear haemagglutinin noose epitope[J]. J Gen Virol, 2009, 90(Pt11):2739-2745. doi：10.1099/vir. 0.013524-0.

[8] Stephanie LL, Nguyen TT, Wenbo X, et al. Genetic characterization of contemporary wild-type measles viruses from Vietnam and the People’s Republic of China: identification of two genotypes within clade H[J]. Virus Res, 2001, 77(1):81-87. doi： 10. 1016/S0168-1702(01)00268-4.

[9] 許文波, 朱貞, 張珍英, 等．麻疹野病毒H1基因型在中國流行的分析[J]. 中國計(jì)劃免疫, 2003, 9(1): 1-8.

[10] Xu S, Zhang Y, Zhu Z, et al. Genetic characterization of the hemagglutinin genes of wild-type measles virus circulating in china, 1993-2009[J]. PLoS One, 2013, 8(9):e73374. doi: 10. 1371/journal. Pone. 0073374.

[11] Xu S, Zhang Y, Rivailler P, Wang H, et al. Evolutionary genetics of genotype H1 measles viruses in china from 1993 to 2012[J]. J Gen Virol, 2014, 95(9):1892-1899. doi: 10. 1099/vir. 0.066746-0.

[12] 孫曉冬, 李崇山, 湯顯, 等．2012年在上海市發(fā)現(xiàn)中國大陸首例輸入性D8基因型麻疹病例[J]. 病毒學(xué)報, 2013, 29(6): 583-588. doi：10.13242/cma. j. issn. 1000-8721.

[13] 高賽珍, 謝穎, 師舞陽, 等．中山市一起輸入性D8基因型麻疹病毒基因特征分析[J]. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 15(2): 200-202.

[14] 張晶波, 吉彥莉, 崔京輝, 等．北京市西城區(qū)2013年輸入性麻疹病毒D8基因型流行分析[J]. 中國病毒病雜志, 2014, 4(4): 272-276. doi：10. 16505/cma. j. issn. 2095-0136.

[15] 李靜, 李國明, 雷亞克, 等．2012-2013年湖北省麻疹病毒流行株核蛋白N基因和血凝素H基因特征分析[J].中華疾病控制雜志, 2015, 19(8):760-764. doi：10. 16462/cma. j. issn. 1674-3679.