高寒春 姚立紅 王超 鄭麗舒

100052北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所高寒春、姚立紅對本文同等貢獻(xiàn)

寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)是一種由蚊子傳播的蟲媒病病毒，可以導(dǎo)致新生兒“小頭癥”。該病毒于1947年最早發(fā)現(xiàn)于烏干達(dá)寨卡叢林的恒河猴體內(nèi)，1956年研究者通過喂食小鼠和猴子感染ZIKV的伊蚊，成功地復(fù)制了ZIKV的感染[1]，1952年第一次從人體分離出來[2-3]。

ZIKV屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)，有包膜的球狀病毒，直徑40～70 nm?；蚪M長度約10.8 kb，為單股正鏈RNA[4]。只有一個開放閱讀框(ORF)，編碼一個多聚蛋白。多聚蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后，剪切加工成3個結(jié)構(gòu)蛋白，即衣殼蛋白(Capsid protein，C)、膜蛋白前體/膜蛋白(Premembrane/Membrane protein，prM/M)和包膜蛋白(Envelope protein，E)，以及7個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)[5]。其中E蛋白與病毒進(jìn)入、組裝和出芽相關(guān)[6]。

桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)(BEVS)是當(dāng)今基因工程領(lǐng)域4大表達(dá)系統(tǒng)之一，安全性高，外源基因克隆容量大，重組病毒易于篩選，不但具備翻譯后加工修飾系統(tǒng)還有高效表達(dá)外源基因的能力[7-8]。本研究采用BEVS成功表達(dá)了ZIKV E蛋白，為ZIKV E蛋白功能研究及疫苗研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及表達(dá)載體sf9細(xì)胞和pFastBacl表達(dá)載體由本科室保存。

1.2主要試劑基因組DNA提取試劑購自Qiagen公司；蛋白質(zhì)Marker購自Fermentas公司；MAX Efficiency DH10BacTM 感受態(tài)細(xì)胞，PureLinkTM HiPure Plasmid Miniprep Kit，CellfectinⅡ轉(zhuǎn)染試劑，昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基sf900-Ⅱ SFM均購自Invitrogen公司；ZIKV E蛋白兔血清抗體，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG均由北京生物制品所贈送；FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建根據(jù)sf9昆蟲細(xì)胞密碼子使用偏性，參考GenBank中ZIKV E蛋白的基因序列，在不改變氨基酸序列的前提下由Invitrogen 公司進(jìn)行優(yōu)化合成，序列兩端分別添加BamHI和EcoRI限制性酶切位點(diǎn)。將優(yōu)化合成的目的片段與pFastBac1載體連接、轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切鑒定，并送Invitrogen公司測序。將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pFB1-E。

1.4重組桿狀病毒骨架質(zhì)粒的構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pFB1-E 轉(zhuǎn)化感受細(xì)態(tài)胞DH10Bac，經(jīng)抗生素和藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆，采用通用引物M13F和M13R進(jìn)行PCR鑒定。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 5 min，30 cycle；72 ℃ 10 min。鑒定正確的重組桿狀病毒骨架質(zhì)粒命名為rBacmid-E。以pFB1轉(zhuǎn)化DH10Bac得到質(zhì)粒rBacmid-N為空白對照。

1.5重組桿狀病毒的包裝及滴度測定將rBacmid-E和rBacmid-N分別轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，陰性對照為不含質(zhì)粒的等量轉(zhuǎn)染試劑，鏡下觀察。細(xì)胞7 d后明顯病變，收集細(xì)胞經(jīng)3次反復(fù)凍融，離心后上清為P1代重組桿狀病毒，命名為rBac-E-P1。rBac-E-P1按MOI=0.1感染對數(shù)生長期的sf9細(xì)胞，出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變時得到P2代病毒，命名為rBac-E-P2，同法獲得P3代病毒。rBacmid-N轉(zhuǎn)染sf9 細(xì)胞重組病毒rBac-N為空白對照。噬斑形成法，檢測重組病毒rBac-E-P3病毒滴度。

1.6檢測重組桿狀病毒E基因插入感染rBac-E和rBac-N的sf9細(xì)胞的病毒基因組為模板，M13F、M13R為引物進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件同前，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.7E蛋白檢測

1.7.1 間接免疫熒光檢測:rBac-N 和rBac-E分別感染96 孔板中sf9 細(xì)胞，72 h后，甲醇固定細(xì)胞，一抗為鼠ZIKV E蛋白單克隆抗體(1∶500稀釋)，二抗為FITC 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶200稀釋)，顯微鏡下觀察熒光。

1.7.2 Western blot檢測:rBac-N和rBac-E分別感染sf9 細(xì)胞3 d，反復(fù)凍融細(xì)胞3次，離心，棄上清，200 μl PBS 重懸沉淀，取20 μl上樣，經(jīng)SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶封閉過夜，一抗為ZIKV E蛋白兔抗血清(1∶500稀釋)，二抗為HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)，TMB顯色。

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)移載體的鑒定轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pFB1-E經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切鑒定，可見1 518 bp的E基因片段，大小與預(yù)期相符。測序結(jié)果與E基因序列同源性為100%。

2.2重組桿狀病毒骨架質(zhì)粒的鑒定rBacmid-E和Rbacmid-N的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，基因片段大小3 830 bp(2 300 bp+1 530 bp)和2 300 bp符合預(yù)期，Bacmid質(zhì)粒上成功整合E基因。

2.3重組桿狀病毒的包裝及病毒滴度轉(zhuǎn)染3 d后，顯微鏡下觀察可見，與陰性對照相比，rBacmid-N、rBacmid-E轉(zhuǎn)染的sf9細(xì)胞變大、變圓，細(xì)胞間距增大；7 d后，大部分細(xì)胞破碎脫落，見圖1。經(jīng)噬斑形成法檢測，第3代重組病毒rBac-E-P3滴度為2.58×105pfu/ml。

圖1 轉(zhuǎn)染后sf9細(xì)胞病變效應(yīng)(100×)Fig.1 Cytopathic effect of transfected sf9 cells(100×)

2.4重組桿狀病毒E基因插入提取感染rBac-N、rBac-E 的sf9細(xì)胞上清中病毒基因組DNA，以M13F、M13R為引物經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定，產(chǎn)物大小與預(yù)期一致，分別為2 300 bp和3 830 bp，見圖2，成功得到ZIKV E基因重組桿狀病毒，命名為rBac-E。

注：M，DNA marker DL15000；1，rBacmid-E基因的PCR產(chǎn)物； 2，rBacmid-N基因的PCR 產(chǎn)物圖2 重組桿狀病毒E基因的PCR 鑒定Note: M，DNA marker DL15000; 1，PCR product of rBacmid-E;2， PCR product of rBacmid-NFig.2 Identification of E gene of rBac-E by PCR

2.5E蛋白的表達(dá)

2.5.1 間接免疫熒光檢測:有強(qiáng)烈的綠色熒光出現(xiàn)的是感染rBac-E的sf9細(xì)胞，而感染rBac-N的陰性對照無熒光，見圖3。說明sf9細(xì)胞經(jīng)重組桿狀病毒rBac-E感染后，ZIKV的E蛋白被成功表達(dá)。

注：A, rBac-N 感染的sf9 細(xì)胞；B, rBac-E 感染的sf9 細(xì)胞；圖3 間接免疫熒光檢測E 蛋白的表達(dá)Note: A, sf9 cell infectioned by rBac-N; B, sf9 cell infectioned by rBac-EFig.3 IFA of expression of E protein

2.5.2 Western blot檢測:感染rBac-N的sf9細(xì)胞裂解上清中未見特異性條帶，感染rBac-E的sf9細(xì)胞裂解上清在相對分子質(zhì)量55×103處有特異性反應(yīng)條帶出現(xiàn)，見圖4。說明E蛋白在rBac-E感染的sf9細(xì)胞中成功表達(dá)。

注：M,蛋白質(zhì)marker；1,rBac-N感染的sf9 細(xì)胞；2,rBac-E 感染的sf9 細(xì)胞圖4 Western blot 檢測E蛋白的表達(dá)Note: M, Protein marker; 1, sf9 cell infectioned by rBac-N; 2, sf9 cell infectioned by rBac-EFig.4 Western blot of expressed E protein

3 討論

ZIKV于1947年被發(fā)現(xiàn)，1952年首次從人體分離出來[2-3]，該病毒在2007年開始出現(xiàn)暴發(fā)流行[3，9]，2015年和2016年，ZIKV在巴西引起了疫情，WHO將該疫情列為國際緊急衛(wèi)生事件[10]。目前認(rèn)為ZIKV通過伊蚊傳播，埃及伊蚊為主要傳播媒介[11]，同時也可能存在其他傳播方式。近日，Tetro等[12]在母親體內(nèi)和胎兒羊水中均檢測出ZIKV核酸，說明其可能垂直感染胎兒。此外，ZIKV還可通過血液接觸或性接觸傳播[13-15]。

當(dāng)ZIKV入侵宿主細(xì)胞時，E蛋白與細(xì)胞表面的受體結(jié)合誘導(dǎo)病毒包膜與細(xì)胞膜融合，核衣殼通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[16]。研究表明，ZIKV E蛋白與其他黃病毒屬病毒具有較高的同源性[17]。我國科研人員已經(jīng)確定了ZIKV E蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其具有明確的3個結(jié)構(gòu)域，與其他黃病毒屬病毒類似[18]。ZIKV E蛋白的結(jié)構(gòu)域III是特異性中和抗體的結(jié)合位點(diǎn)，是ZIKV抗體及疫苗研發(fā)的重要靶點(diǎn)[19]。

美國華爾特里德陸軍研究所針對ZIKV包膜prM和E蛋白研發(fā)出ZIKV滅活疫苗，免疫接種的8只恒河猴均產(chǎn)生了特異性抗體，感染ZIKV后，在血液、尿液及其他分泌物中均未檢測到ZIKV[20]。美國Inovio 公司和韓國Gene One Life Science 公司合作開發(fā)了ZIKV DNA疫苗GLS5700。法國Valneva 公司、日本Takeda公司、巴西免疫生物技術(shù)研究所、美國NewLink公司等也已展開ZIKV滅活疫苗的研發(fā)。哈佛大學(xué)構(gòu)建了表達(dá)ZIKV E蛋白的52型恒河猴重組腺病毒載體，免疫小鼠后可產(chǎn)生中和抗體，且在恒河猴體內(nèi)產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答[21]。此外，美國Protein Sciences公司利用基因工程桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)技術(shù)平臺與阿根廷Sinergium公司合作，正在進(jìn)行ZIKV重組E蛋白疫苗的研發(fā)。綜上所述，全球有30多個機(jī)構(gòu)在進(jìn)行ZIKV疫苗的研發(fā)，涉及到滅活疫苗、嵌合病毒疫苗、核酸疫苗、載體疫苗、亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗和合成肽疫苗7大類。

Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種常見的外源基因表達(dá)體系，其特點(diǎn)是高效、迅速、易于操作能夠在大腸桿菌內(nèi)快速構(gòu)建重組病毒[22]。本研究根據(jù)所要表達(dá)ZIKV E蛋白的基因和結(jié)構(gòu)特性以pFastBac1為供體質(zhì)粒構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化DH10Bac大腸桿菌，得到重組質(zhì)粒rBacmid-E，轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒rBac-E，并進(jìn)行了ZIKV E蛋白的表達(dá)和鑒定，為進(jìn)一步研究ZIKV E蛋白的功能及ZIKV疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

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