林琳 陳愛珺 李利利 李金松

100052 北京,中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(林琳、陳愛珺、李利利、李金松)；250014 濟(jì)南，山東省疾病預(yù)防控制中心艾滋病防治所 山東大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院 山東省傳染病預(yù)防控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(林琳)

甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus，HAV)為小RNA病毒科嗜肝病毒屬，正鏈RNA病毒。甲肝病毒在人和靈長類動物、旱獺和鴨群中廣泛存在[1-4]。甲肝病毒主要通過糞口途徑傳播，在人群中常通過食物和水傳播，并引起暴發(fā)和流行。人類感染甲肝病毒后，大多表現(xiàn)為亞臨床或隱性感染，僅少數(shù)人發(fā)展為急性甲型肝炎。一般可完全恢復(fù)，不會轉(zhuǎn)為慢性肝炎，亦無慢性攜帶者。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)每年全球約有一千萬人感染甲肝病毒，約有100萬人發(fā)病[2, 5]。

喜馬拉雅旱獺病毒(Marmota himalayana hepato-virus，MHHAV)是近年來在我國青海的旱獺糞便中發(fā)現(xiàn)的一種新型的甲肝病毒。該病毒在旱獺糞便中檢出率為16.16%，并且在肝、脾、肺、血液等器官中均可檢測到病毒RNA。進(jìn)化分析提示該病毒與以往發(fā)現(xiàn)的靈長類甲肝病毒、人甲肝病毒和海豹甲肝病毒屬于不同分支[1]。

類器官或類組織三維培養(yǎng)是近年來發(fā)展起來的一種干細(xì)胞培養(yǎng)法，常見的有腸道、肝和甲狀腺等類器官或類組織三維培養(yǎng)體系等[6]。腸道類組織培養(yǎng)是將小鼠或人的小腸組織在消化酶的作用下，分離出腸道隱窩，在體外通過含有多種細(xì)胞因子的培養(yǎng)基使腸道隱窩中的干細(xì)胞分化，形成擁有部分腸道隱窩體內(nèi)結(jié)構(gòu)和功能的類組織[7]。目前類組織主要用于藥物研究、病毒分離、疾病模型等研究[6]。已有報道腸道類組織成功實(shí)現(xiàn)多種體外難培養(yǎng)或常規(guī)二維細(xì)胞培養(yǎng)不能分離培養(yǎng)的病毒，如輪狀病毒和諾如病毒等[8]。

1 材料與方法

1.1材料Vero、Vero-E6、DH82、人胚肺二倍體細(xì)胞(2BS)來自中國疾病預(yù)防控制中心病毒病防制所腹瀉室實(shí)驗(yàn)室凍存或購于國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺，MHHAV糞便標(biāo)本為檢測陽性的野外采集的旱獺MMHAV陽性標(biāo)本，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室Real-time qPCR定量確定為陽性的糞便標(biāo)本。胎牛血清，MEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基，Advanced DMEM/F12、Glutamax 100x、HEPES 1 M、Penicillin-streptomycin 100x、B27 supplement 50x、N2 supplement 100x、Glutamax、Mouse EGF 500 μg/ml、EDTA、0.25%胰酶等購自Invitrogen；Standard BD Matrigel matrix(BD Bios-ciences, 美國)，Mouse Noggin 100 μg/ml(Peprotech,美國)，Nicotinamide(Sigma,美國)，核酸提取試劑盒購自QIAgen, Real-time qPCR試劑盒購自ABI，引物探針等在Invitrogen公司合成。Balb/C小鼠購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2方法

1.2.1 常規(guī)二維細(xì)胞分離培養(yǎng)MHHAV：復(fù)蘇Vero、Vero-E6、DH82、人胚肺二倍體細(xì)胞(2BS)細(xì)胞，待細(xì)胞生長良好后，將旱獺甲肝陽性糞便標(biāo)本用MEM培養(yǎng)基稀釋成10%便懸液，8 000×g離心后，吸取上清，分別用0.45 μm和0.22 μm的濾器過濾。96孔板細(xì)胞接種次日，去掉培養(yǎng)基，每孔接種100 μl病毒懸液，病毒孵育1 h后，去掉上清，清洗三遍后，加入含1%血清和雙抗的培養(yǎng)基。于0、1、6、12、24 d各取5孔培養(yǎng)上清(包括細(xì)胞)，凍于-80 ℃待用[9-10]。

1.2.2 小鼠腸道類組織培養(yǎng)： 腸道隱窩分離培養(yǎng)：頸部脫臼處死小鼠(Balb/C)；用酒精消毒浸泡小鼠1 min：取出小腸，放于裝有已預(yù)冷的PBS的培養(yǎng)皿中。取小腸中段(去掉胃以及胃下約2～3 cm的腸段，然后切下約10 cm的空腸)，去除小腸上附著的脂肪；換到新的裝有預(yù)冷的PBS培養(yǎng)皿中，縱向剪開小腸；在預(yù)冷的PBS中沖洗，用蓋玻片輕柔緩慢的刮掉小腸絨毛，用PBS洗兩遍；將小腸切成約0.2 cm～0.5 cm長的小段，轉(zhuǎn)移到含有20 ml預(yù)冷的PBS的50 ml離心管內(nèi)，震蕩去除游離絨毛等。為了松動隱窩，用10 ml吸頭上下吹打10次使組織完全懸浮，然后用70 μm細(xì)胞過濾器把組織濾掉。 濾過的液體中加入終濃度10%的FBS，吹打幾次，4 ℃，300×g離心5 min，去上清；將隱窩重懸于10 ml CM-GF培養(yǎng)液(97% Advanced DMEM/F12+1% 100×Glutamax+1% 100× Pen/Strep)中，4 ℃、150×g離心5 min以收集隱窩。將約100個隱窩懸浮于30 μl的基質(zhì)膠(Matrigel)中，放入37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中約15 min。等待基質(zhì)膠凝固后，每孔加入500 μl含有各類生長因子的CMGF培養(yǎng)液。觀察類組織生長情況，每2 d更換一次CMGF培養(yǎng)液[11-12]。

1.2.3 病毒接種：新分離或復(fù)蘇的腸道類組織，培養(yǎng)6 d后，去上清后加入4 ℃的CM-GF培養(yǎng)液，吹打幾次，使基質(zhì)膠融化，使用預(yù)冷CM-GF培養(yǎng)液清洗三遍，并用預(yù)冷PBS清洗一遍，加入含有0.5 mmol/L EDTA的PBS將類組織分散，而后使用CM-GF培養(yǎng)液洗去EDTA，離心去上清，并加入4%基質(zhì)膠的CMGF培養(yǎng)液與類組織混勻，50 μl每孔接種于96孔板，每孔含約20～25個類組織，培養(yǎng)2 d。小心吸去培養(yǎng)基，將處理好的病毒標(biāo)本過濾液每孔接種100 μl，37 ℃孵育1 h后，小心去上清，使用CM-GF培養(yǎng)液小心清洗三遍后，加入100 μl CMGF培養(yǎng)液 1，于0、6、24、48、96 h各取3孔，并仔細(xì)將細(xì)胞沖洗下來，凍于-80 ℃待用[13]。

1.2.4 核酸提取:將收集的培養(yǎng)液在-80 ℃和37 ℃反復(fù)凍融5次，使細(xì)胞或腸道隱窩破裂釋放出病毒顆粒，用PBS將每個標(biāo)本配成140 μl總量，采用Viral Nucleic Acid Extract Kit II，按說明書提取核酸。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)品制備:使用PS (MHHAVF: 5′- GTCCTCTTTAAGGCACTCAT -3′)20 pmol/L，PX(MHHAVR:5′ -TGGGTCAGTCCATCTGGCAAG-3′)20 pmol/L擴(kuò)增后，回收條帶，測序確認(rèn)后，克隆進(jìn)入DH5α。擴(kuò)增后，提取質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)錄成RNA[1]。

圖1 顯微鏡下小鼠腸道類組織生長狀態(tài) 比例尺：100 μmFig.1 Growth of mouse intestinal enteroids under microscope Scale bar: 100 μm)

1.2.6 病毒增殖檢測:病毒拷貝數(shù)使用Real-time qPCR方法測定：2×QuantiTect Probe RT-PCR Master Mix 12.5 μl；QuantiTect RT Mix 0.25 μl；20 pmol/L PS 1 μl，20 pM PX 1 μl，(MHHAV Probe: 5′-FAM- CATCTTCATTTCCCTGGCTCTCACC-MGB -3′)探針10 PM 0.5 μl，RNAse-FREE水7.25 μl；2.5 μl 模板RNA或108至100拷貝/ μl的10倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品。反應(yīng)條件為：50 ℃ 30 min； 95 ℃ min；95 ℃ 15 s、58 ℃ 30 s，40個循環(huán)，在58 ℃收集熒光信號[1]。

2 結(jié)果

2.1常見二維培養(yǎng)細(xì)胞系中未見病毒增殖在上述幾種常見的甲肝病毒分離細(xì)胞系，不同時間點(diǎn)收集的培養(yǎng)液和相應(yīng)的孵育細(xì)胞所提取的核酸中，使用Real-time qPCR定量檢測，除0 h外，各時間點(diǎn)均未檢測到病毒核酸。在細(xì)胞培養(yǎng)液和培養(yǎng)的細(xì)胞收集前也未觀察到細(xì)胞有病變。

2.2建立腸道類組織培養(yǎng)體系分離出的小鼠腸道隱窩在培養(yǎng)液中存活，在顯微鏡下可見腸隱窩在分離后分布在基質(zhì)膠中。在24 h左右，隱窩閉合，開始膨脹形成腸球。5～7 d后，形成類似空腸腸腔樣結(jié)構(gòu)，并在7 d的時候出現(xiàn)萌芽突起，13 d后形成腸管樣結(jié)構(gòu)(圖1)。

表1 CMGF培養(yǎng)基(4℃保存期2周)

2.3MHHAV在小鼠腸道類組織上增殖MHHAV可以在小鼠腸道類組織上增殖，在接種6 h后，幾乎檢不出病毒，但在接下來的時間節(jié)點(diǎn)上病毒拷貝數(shù)逐漸增高，但整個過程未見細(xì)胞病變。計(jì)算拷貝數(shù)0 h點(diǎn)平均病毒RNA載量為3.6×103拷貝/ml(3.6×103±306 拷貝/ml)，6 h點(diǎn)未檢測到病毒核酸，24 h點(diǎn)為1.5×104拷貝/ml(1.5×104±1.2×103拷貝/ml)；48 h點(diǎn)為5.4×105拷貝/ml(5.4×105±1.32×103拷貝/ml)，96 h點(diǎn)為1.34×107拷貝/ml(1.34×107±4.33×103拷貝/ml)，病毒在4 d時間有大約3 700倍增殖。

3 討論

病毒進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)通常通過細(xì)胞的受體或某些特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)或成分，如丙型肝炎病毒通常通過低密度脂蛋白受體進(jìn)入細(xì)胞[14]，病毒不能在某些細(xì)胞上培養(yǎng)通常是因?yàn)樵擃惣?xì)胞缺乏病毒的特異受體，病毒不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致分離培養(yǎng)失??；病毒能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，但是細(xì)胞內(nèi)缺乏病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、裝配和釋放出細(xì)胞的某些條件，可能會導(dǎo)致病毒分離培養(yǎng)失敗，如腺相關(guān)病毒等需要輔助病毒相助才能在細(xì)胞內(nèi)裝配出新的子代病毒[15]。人甲肝病毒具有嗜肝特征，并能通過糞口途徑感染，也能在多種細(xì)胞系上生長，但是滴度很低、生長很慢，初次分離的甲肝病毒能適應(yīng)的細(xì)胞系很局限，而經(jīng)過細(xì)胞適應(yīng)的甲肝病毒毒株核酸序列變異較大，并且能夠感染多種細(xì)胞[16]。

MHHAV具有與其他類型甲肝病毒不一樣的特征，其核酸序列與已知的甲肝序列差異較大，如抗原位點(diǎn)的氨基酸序列與人和靈長類甲肝病毒不一樣；與人的甲肝病毒相比，5′-UTR區(qū)缺乏第一個結(jié)構(gòu)域和頸環(huán)結(jié)構(gòu)Ia，還缺乏第V結(jié)構(gòu)域的假結(jié)，而MHHAV的第III莖環(huán)結(jié)構(gòu)是一個多回路的三葉草結(jié)構(gòu)，可能有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，這個區(qū)域與人甲肝病毒一樣非常保守，但是這個IRES的3′邊緣，有UUUCC和AUG兩個box基因，與人甲肝病毒的RNA復(fù)制順式作用元件功能相似，但是這個區(qū)域核酸與人甲肝病毒也有較大差異[1]?；谏鲜鯩HHAV和人甲肝病毒的差異，本研究使用二維培養(yǎng)的多種細(xì)胞系的培養(yǎng)過程中均未見甲肝病毒的增殖。

體外三維培養(yǎng)的腸道類組織在基質(zhì)膠上形成了腸道隱窩的基本結(jié)構(gòu)，與二維培養(yǎng)時具有較大區(qū)別:首先其擁有多種細(xì)胞，是多種腸道上皮細(xì)胞，并分化出了腸道絨毛，多種細(xì)胞具有的受體更加豐富，可能包含了MHHAV的受體，使其更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；其次三維培養(yǎng)的腸道隱窩具有體內(nèi)腸道隱窩的基本功能[7-8]，使MHHAV在細(xì)胞內(nèi)能更容易復(fù)制、裝配和釋放等；另外旱獺也是嚙齒類動物，小鼠是典型的嚙齒類動物，沒有種屬特異性干擾，因此MHHAV在小鼠腸道類組織中更容易感染和復(fù)制。本研究的三維培養(yǎng)結(jié)果與國外報道一致[17- 18]，MHHAV在小鼠腸道類組織中被檢測到的時間也比人甲肝病毒在細(xì)胞培養(yǎng)時早，可能與腸道類組織具有腸道隱窩體內(nèi)基本功能有關(guān)，還需進(jìn)一步研究。

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